蘿卜霜霉病抗性鑒定與相關(guān)基因克隆.pdf

1、蘿卜（Raphanus sativus L.）是原產(chǎn)于我國(guó)的重要蔬菜作物，為十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物。由寄生霜霉菌（Hyalonosporan parasitica）侵染產(chǎn)生的霜霉病是十字花科蔬菜上的重要病害。近幾年，春季蘿卜霜霉病的發(fā)生嚴(yán)重，尤其是在溫度適宜，潮濕的環(huán)境下更易發(fā)生，此病害在蘿卜生長(zhǎng)的子葉期、苗期及成株期都容易發(fā)生，嚴(yán)重影響了蘿卜的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，蘿卜抗病育種是目前重要的育種目標(biāo)之一。十字花科蔬菜霜霉病的研究主

2、要集中在蕓薹屬蔬菜，如白菜、甘藍(lán)、花椰菜及青花菜等作物上。蘿卜霜霉病抗性的研究剛剛起步，而蘿卜霜霉病抗性鑒定的綜合評(píng)價(jià)體系還未建立，其生理指標(biāo)、抗性遺傳及抗病基因方面的研究國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道，限制了蘿卜霜霉病抗病育種的進(jìn)展及新品種選育工作。因此，本研究從抗性評(píng)價(jià)體系建立、生理指標(biāo)的抗性反應(yīng)、抗性遺傳機(jī)制及抗病基因克隆四個(gè)方面對(duì)蘿卜霜霉病的生理基礎(chǔ)及遺傳學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，為蘿卜種質(zhì)資源的抗性評(píng)價(jià)及抗霜霉病品種的選育提供了理論依據(jù)及

3、技術(shù)參考。
　　 采用田間自然發(fā)病與室內(nèi)接種鑒定相結(jié)合的方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的蘿卜種質(zhì)資源進(jìn)行霜霉病抗性篩選，建立了蘿卜植株子葉期、苗期及成株期的霜霉病病害評(píng)價(jià)體系。對(duì)500個(gè)蘿卜種質(zhì)的田間霜霉病抗性進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)葉簇平展、皮色為紅色或青色、株型為塌地型的蘿卜植株更容易感染霜霉病。選取20個(gè)蘿卜材料進(jìn)行室內(nèi)人工接種鑒定，結(jié)果顯示高抗品種在其生長(zhǎng)的整個(gè)過(guò)程中都表現(xiàn)較好的抗性，高感材料子葉期病害尤其嚴(yán)重，且此鑒定結(jié)果與田間自然條件下的

4、病害表現(xiàn)一致。對(duì)植株進(jìn)行抗性相關(guān)性分析表明，子葉期及苗期分別與成株期抗性呈顯著性正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2=0.9778，R2=0.8519）。因此，蘿卜子葉期或苗期的病害表現(xiàn)可以反映其成株期的抗性情況。
　　 對(duì)多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性與蘿卜霜霉病抗性的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，抗病材料在接種病原菌不同時(shí)段后，植株體內(nèi)PPO、POD、CAT、SOD與蘿卜抗病性

5、呈顯著正相關(guān)，且分別在不同的處理時(shí)間達(dá)到峰值；方差分析顯示，各個(gè)酶活性的峰值與其他接種時(shí)段相比，差異達(dá)到極顯著水平。而感病自交系中的防御酶活性與植株抗病性無(wú)相關(guān)性，方差分析差異不顯著。表明植株防御酶活性可作為蘿卜霜霉病抗性鑒定的輔助評(píng)價(jià)指標(biāo)。
　　 以蘿卜抗感病材料NAU-XBY06×NAU-SH08，NAU-DHP07×NAU-BJQ09配制的P1，P2，F(xiàn)1，F(xiàn)2，BC1，BC2六世代為材料進(jìn)行了蘿卜霜霉病抗性遺傳分析。分析

6、結(jié)果表明，兩個(gè)雜交組合的所有F1都表現(xiàn)高抗?。籉2群體的抗感分離比接近3:1；與抗病親本回交的BC群體都是抗病的，而與感病群體回交的BC群體則呈現(xiàn)1:1的分離。由此得出，蘿卜苗期霜霉病的抗性符合單基因顯性遺傳模式，且F2及BC群體的正反交無(wú)差異，表明此抗性無(wú)母性遺傳效應(yīng)。
　　 根據(jù)擬南芥霜霉病抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，以蘿卜高抗病自交系NAU-XBY06的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增。結(jié)果得到了長(zhǎng)度為2372bp

7、，924bp，636bp及607bp的抗病基因片段，分別命名為Rs-dm1，Rs-dm2，Rs-dm3，Rs-dm4。分析其核苷酸及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表明，Rs-dm1與擬南芥霜霉病抗病基因RPP8同源性達(dá)61％；推測(cè)其氨基酸序列具有NBS-LRR類(lèi)型的保守區(qū)域。Rs-dm2，Rs-dm3，Rs-dm4的NCBI及同源樹(shù)分析表明，它們分別與擬南芥的霜霉病抗病基因RPP1，RPP5刪及RPP27有較高的同源性，且推測(cè)它們的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分別具有TIR