慢性濕疹患者皮損白細(xì)胞介素18的表達(dá)及意義.pdf

1、研究背景：濕疹是由多種內(nèi)、外因素引起的真皮淺層及表皮炎癥。病因復(fù)雜，一般認(rèn)為是由多種內(nèi)、外因素相互作用所致，其發(fā)病機(jī)制可能與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)(1)。而遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，有多種細(xì)胞因子參與，尤其是2型輔助性T細(xì)胞(Thelpercell，Th2)因子，如白細(xì)胞介素4(Interleukin4，IL-4)，白細(xì)胞介素10(Interleukin10，IL-10)，白細(xì)胞介素13(Interleukin13，IL-13)等，可促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。1

2、型輔助性T細(xì)胞(Thelper1，Th1)因子，如γ-干擾素(Interferonγ，IFN-γ)，白細(xì)胞介素2(Interleukin2，IL-2)等可抑制該反應(yīng)的進(jìn)行。 白細(xì)胞介素18(Interleukin18，IL-18)是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，最初認(rèn)為其是IFN-γ誘導(dǎo)因子，與IL-12共同作用可增強(qiáng)IFN-γ基因的表達(dá)(2-4)，增強(qiáng)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)(6)。后來大量研究發(fā)現(xiàn)，IL-18也可誘導(dǎo)Th2

3、型細(xì)胞因子、免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE，IgE)及免疫球蛋白G1(ImmunoglobulinG1，IgG1)的產(chǎn)生(7-12)。Yoshimoto等研究發(fā)現(xiàn)IL-18可刺激肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子和組織胺，后二者均可誘導(dǎo)和加重遲發(fā)型超敏反應(yīng)(13)。建立血清高水平IL-18皮膚特異性半胱天冬酶1(Caspase-1)轉(zhuǎn)基因鼠，可以檢測(cè)到其血清中存在高水平的IgE(14)。研究發(fā)現(xiàn)，在鼠模型中，利用抗

4、原和IL-18共同刺激被動(dòng)轉(zhuǎn)移的Th1型記憶淋巴細(xì)胞，可以產(chǎn)生Th1、Th2型細(xì)胞因子，繼而誘導(dǎo)氣道炎癥和皮膚超敏反應(yīng)。HidenoriOhnishi等檢測(cè)51名具有過敏素質(zhì)的兒童血清中IL-18，其水平顯著高于健康兒童組(15)。李燕等檢測(cè)支氣管哮喘患者血清中IL-18水平也顯著高于健康對(duì)照組(16)。這些研究表明，IL-18與過敏性疾病密切相關(guān)。到目前為止，查閱國(guó)內(nèi)外有關(guān)資料，未見關(guān)于IL-18與慢性濕疹的相關(guān)性研究。本研究聯(lián)合測(cè)定

5、皮膚和血清中IL-18、IFN-γ的水平，與正常對(duì)照比較，并對(duì)其與慢性濕疹患者病情評(píng)分的相關(guān)性進(jìn)行研究，以探討IL-18在慢性濕疹發(fā)病機(jī)制中的作用。 研究目的：檢測(cè)慢性濕疹患者皮損中IL-18mRNA、IFN-γmRNA水平；血清中IL-18蛋白、IFN-γ蛋白水平；分析皮損與血清中IL-18的水平與濕疹病情評(píng)分的關(guān)系，探討IL-18在慢性濕疹發(fā)病中的作用。 材料和方法：1、研究對(duì)象1.1確定病人入選標(biāo)準(zhǔn)：1.1.1病程

6、超過6周；1.1.2病因不明；1.1.3皮疹以苔蘚樣變?yōu)橹?，有滲出史；1.1.4瘙癢劇烈；1.1.5對(duì)稱分布；1.1.6皮膚組織病理符合慢性濕疹改變；1.1.7性別不限，年齡16歲至65歲；1.1.8兩周內(nèi)未使用過抗組胺藥物、類固醇激素及免疫抑制藥物；1.1.9同意進(jìn)行皮膚病理活檢和抽取靜脈血進(jìn)行該試驗(yàn)。 1.2滿足以上標(biāo)準(zhǔn)者均可入選病例組，共27例，其中男性12例，女性15例，最大年齡65歲，最小年齡16歲，平均年齡41±11

7、.9。均為2005年10月至2006年2月中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科病人。 1.3正常對(duì)照選取整形外科手術(shù)之正常皮膚組織和健康體檢者血清。皮膚組織正常對(duì)照組12例，男性7例，女性5例，最大年齡56歲，最小年齡24歲，平均年齡36±8.7；血清正常對(duì)照組12例，男性6例，女性6例，最大年齡44歲，最小年齡17歲，平均年齡為31±10.3。 1.4各組間年齡和性別構(gòu)成比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。 2、實(shí)驗(yàn)方法2.

8、1收集標(biāo)本2.1.1對(duì)每例慢性濕疹患者選用典型皮損，按常規(guī)皮膚病理活檢取材，切取面積1cm×0.5cm梭形皮損。一部分皮損用于病理活檢，一部分皮損剪除脂肪組織(重50mg左右)，用DEPC滅菌三蒸水清洗，置于-80℃冰箱待檢；正常對(duì)照選自整形外科切除的正常皮膚，剪除脂肪組織(重50mg左右)，用DEPC滅菌三蒸水清洗，置于-80℃冰箱待檢。 2.1.2按常規(guī)抽取外周靜脈血4ml，4℃靜置1h，4℃，3000r/min離心10mi

9、n，分裝入EP管中，置于-80℃冰箱待檢。 2.2用1998年Hanifin提出的“濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)”(EczemaAreaandSeverityIndex，EASI)對(duì)慢性濕疹患者的臨床表現(xiàn)進(jìn)行病情評(píng)分。 2.3用RT-PCR方法檢測(cè)皮損中IL-18mRNA、IFN-γmRNA表達(dá)水平取-80℃低溫保存的皮膚組織標(biāo)本，在液氮中研磨成粉末，用Trizol(Invitrogen)常規(guī)提取總RNA，取10μl總RNA，按

10、試劑盒說明書(Promega)反轉(zhuǎn)錄合cDNA，取2μlcDNA加入25μlPCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取5μlPCR產(chǎn)物電泳，用凝膠圖像分析軟件(UVIgelstartMw)分析，結(jié)果以目的條帶與β-actin密度比值表示。 2.4用ELISA方法檢測(cè)血清中IL-18蛋白、IFN-γ蛋白水平將-80

11、℃低溫保存的血清標(biāo)本復(fù)溶，嚴(yán)格按試劑盒說明書(IL-18試劑盒為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品，IFN-γ試劑盒為法國(guó)DIACLONE公司產(chǎn)品)進(jìn)行操作。往已包被了一抗的板條各孔中依次加入二抗和酶標(biāo)抗體工作液，并加入底物及終止液，顯色后在分光光度計(jì)中492、450nm處讀取吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度OD值在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)人IL-18和IFN-γ含量。 3、統(tǒng)計(jì)方法結(jié)果以x±s表示，采用SPSS

12、13.0統(tǒng)計(jì)軟件作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)分析。 結(jié)果：1、病例組與對(duì)照組皮膚組織IL-18mRNA及IFN-γmRNA表達(dá)水平慢性濕疹患者和正常對(duì)照皮膚組織均有IL-18mRNA及IFN-γmRNA表達(dá)，但在慢性濕疹患者皮損中兩者的表達(dá)均高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見表1： 2、血清IL-18蛋白及IFN-γ蛋白水平慢性濕疹患者血清IL-18蛋白水平顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IFN-γ

13、蛋白均數(shù)水平低于正常對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見表2： 3、IL-18表達(dá)與疾病活動(dòng)性的關(guān)系3.1皮膚組織中IL-18mRNA及IFN-γmRNA的表達(dá)量與濕疹病情評(píng)分：IL-18mRNA及IFN-γmRNA的表達(dá)量與濕疹病情評(píng)分均呈正相關(guān)(P＜0.01)； 3.2血清中IL-18蛋白及IFN-γ蛋白水平與濕疹病情評(píng)分：IL-18蛋白及IFN-γ蛋白水平與濕疹病情評(píng)分相關(guān)性不明顯(P＞0.05)。 4、IL

14、-18與IFN-γ的關(guān)系4.1皮膚組織中IL-18mRNA表達(dá)量與IFN-γmRNA表達(dá)量：IL-18mRNA表達(dá)量與IFN-γmRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(P＜0.01)；4.2血清中IL-18蛋白水平與IFN-γ蛋白水平：IL-18蛋白水平與IFN-γ蛋白水平無相關(guān)性(P＞0.05)。 結(jié)論：1、病例組皮損中IL-18mRNA的表達(dá)量和血清中IL-18蛋白水平均顯著高于對(duì)照組，其中皮損IL-18mRNA的表達(dá)量與濕疹病情評(píng)分呈正相