登革病毒感染性轉(zhuǎn)錄體技術(shù)新途徑的初步研究.pdf

1、一、研究背景和目的 登革病毒(Denguevirus，DEN)為黃病毒屬成員，是引起登革熱(DF)和登革出血熱(DHF)/登革休克綜合癥(DSS)的病原體，有4種不同的血清型(1-4型)。主要傳播媒介是埃及伊蚊和白蚊伊蚊。流行于熱帶和亞熱帶的100多個國家和地區(qū)，我國自1978年以來主要在海南、廣東、廣西、臺灣和福建等東南沿海地區(qū)發(fā)生。世界衛(wèi)生組織估計全球每年DF發(fā)病人數(shù)約5千萬到1億，并導(dǎo)致25至50萬DHF病例和2.4萬人死

2、亡。DF已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，因此加強(qiáng)對登革病毒致病機(jī)理及疫苗研究具有重要的現(xiàn)實意義。 登革病毒屬黃病毒屬(Flavivirus)，是一類有包膜的單股、正鏈RNA病毒，在復(fù)制過程中不形成DNA中間體，因此要在基因水平研究其特征存在一定的困難，因為突變、重組、克隆等分子生物學(xué)技術(shù)都是在DNA水平上的操作。感染性轉(zhuǎn)錄體技術(shù)提供了解決這一難題的新途徑。該技術(shù)是把病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并置于RNA聚合酶啟動子的下游，

3、在RNA聚合酶的作用下體外轉(zhuǎn)錄出全長正鏈RNA，經(jīng)轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞后復(fù)制出子代病毒顆粒。由于這種子代病毒來自cDNA，研究者就可以在DNA水平上進(jìn)行操作，從而達(dá)到人為改造病毒，研究其復(fù)制、表達(dá)與致病機(jī)理的目的。 本研究選擇登革2型病毒(Dengue2virus，DEN2)NGC株進(jìn)行感染性轉(zhuǎn)錄體技術(shù)新途徑的初步研究。通過長鏈RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增DEN2NGC株全長基因組。運用感染性轉(zhuǎn)錄體技術(shù)，進(jìn)行DEN2NGC株全長cDNA的轉(zhuǎn)錄

4、，并對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄體感染性研究。通過分段克隆，構(gòu)建DEN2NGC株全長基因組亞克隆。為構(gòu)建登革病毒的感染性克隆、深入闡明病毒的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 二、研究方法 1、根據(jù)DEN2NGC株基因組全序列(GenBankAccessNumber：AF038403)，利用DNAstar軟件包設(shè)計并合成用于擴(kuò)增全長基因組的引物2(+)、2(-)。 2、將DEN2NGC株經(jīng)乳鼠腦內(nèi)接種傳代，從受染鼠腦中提取總RNA，運用長鏈RT

5、-PCR技術(shù)，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，實現(xiàn)對DEN2NGC株全長基因組的擴(kuò)增。 3、利用DNAstar軟件包設(shè)計、合成DEN2NGC株基因組序列特異的3對引物2.1～2.3。以純化的約11Kb的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將3個特異片段純化后分別克隆于pGEM-T載體后進(jìn)行序列測定。 4、以DEN2NGC株全長基因組cDNA為模板，用SP6RNA聚合酶系統(tǒng)制備體外轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)錄體，分別經(jīng)乳鼠腦內(nèi)接種及電穿孔轉(zhuǎn)染BHK-2

6、1細(xì)胞，以乳鼠神經(jīng)毒力和細(xì)胞病變?yōu)橛^察指標(biāo)，判斷是否有恢復(fù)登革病毒產(chǎn)生。 5、對出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的乳鼠腦組織和出現(xiàn)病變的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察，并提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增、克隆測序，以對恢復(fù)病毒進(jìn)行鑒定。 6、根據(jù)DEN2NGC株基因組全序列，利用DNAstar軟件包設(shè)計并合成覆蓋病毒基因組全長的2個片段P1、P2。 7、將DEN2NGC株經(jīng)乳鼠腦內(nèi)接種傳代，應(yīng)用RNeasyMiniKit從受染鼠腦中

7、提取總RNA，以SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈病毒cDNA。 8、以P1、P2兩片段引物進(jìn)行擴(kuò)增，純化片段分別克隆至pCR-XL-TOPO載體，通過酶切、PCR方法鑒定后測序。 三、研究結(jié)果 1、以DEN2NGC株乳鼠鼠腦中提取的RNA為模板，利用下游引物2(-)反轉(zhuǎn)錄，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物于0.7％瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)有約11kbDNA片段，分子量大小與預(yù)計相符。 2、以

8、純化的約11Kb的PCR產(chǎn)物為模板，利用針對DEN2NGC株基因組序列特異的3對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。電泳圖譜顯示，用上述3對引物擴(kuò)增出的3個片段與預(yù)期大小一致。將3個特異片段純化分別克隆于pGEM-T載體后進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果與DEN2NGC株病毒的相應(yīng)序列一致，證明我們擴(kuò)增出全長基因組為DEN2NGC株所特有。 3、以純化的全長cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用Promega公司SP6RNA聚合酶系統(tǒng)在m7G帽子結(jié)構(gòu)類似物和4

9、種NTP存在下將其體外轉(zhuǎn)錄成RNA。轉(zhuǎn)錄體在其5'端加上m7G帽子結(jié)構(gòu)類似物，以增加感染性。病毒cDNA可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生達(dá)微克級的RNA，實驗具有良好的重復(fù)性。轉(zhuǎn)錄體RNA為單鏈結(jié)構(gòu)(為約11kb的單鏈RNA)，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNaseA消化后，特異條帶消失，證明轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物確為RNA。 4、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過乳鼠腦內(nèi)接種及電穿孔轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，獲得恢復(fù)病毒，并利用RT-PCR擴(kuò)增、克隆測序以及電鏡觀察。結(jié)果表明，恢復(fù)病毒確為DEN2。通過

10、在乳鼠腦及BHK-21細(xì)胞中傳代，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)病毒與DEN2NGC株病毒具有類似的感染性。 5、根據(jù)DEN2NGC基因組序列上所含有的酶切位點，將病毒基因組分為2個片段進(jìn)行擴(kuò)增，各片段分別以P1、P2表示，其大小應(yīng)分別為5568bp、5186bp。0.7％的瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致。 6、將P1、P2兩個片段分別與pCR-XL-TOPO載體連接，轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒

11、進(jìn)行PCR及酶切鑒定。結(jié)果表明，片段大小均與預(yù)期一致。 7、利用M13通用引物進(jìn)行序列測定，測得序列經(jīng)BLASTn程序進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)部分是DEN2NGC株病毒對應(yīng)序列，部分為pCR-XL-TOPO載體序列，其中登革病毒部分與DEN2NGC株核酸序列同源性100％，另一部分與pCR-XL-TOPO載體序列完全一致。證明我們所構(gòu)建重組質(zhì)粒的插入序列是DEN2NGC株特異的。 四、結(jié)論 1、運用長鏈RT-PCR技