病毒感染性疾病的實驗室診斷

1、病毒的發(fā)現(xiàn)與研究歷史,病毒病由來已久 公元前二至三個世紀 天花 中國 公元十世紀 接種人痘預防天花 1796英國醫(yī)生琴納 牛痘使人預防天花 阿里斯多德在公元前四世紀 狂犬病 法國人巴斯德在1884年 狂犬疫苗,病毒學的發(fā)展歷程,病毒的病原研究階段病毒的化

2、學和結(jié)構(gòu)研究階段 病毒研究的細胞水平時期 分子病毒學的研究時期,病毒病的病原研究階段,自病毒發(fā)現(xiàn)直到上個世紀30年代初，病毒學研究主要集中在：分離和鑒定 引起各種病毒性疾病的病毒；病毒對疾體所引起的特異性病理效應；病毒 的傳播方式和感染宿主范圍；各種理化因子對病毒感染的影響等方面。在這一階段，人們對病毒本質(zhì)的認識還很膚淺，認為病毒是一種與細菌類 似的病原體，所不同的僅在于病毒必須在生活的細胞內(nèi)才能繁殖

3、，再就是 體積十分微小，以致在顯微鏡下不能見到，能夠通過細菌濾器。這也正是 在那一時期把病毒稱之為“超顯微的濾過性病毒”的原因。,病毒的化學和結(jié)構(gòu)研究階段,1934年M.Schlesinger獲得了純化的噬菌體；1935年，美國生化學家Stanley第一次提純了煙草花葉病毒（簡稱TMV），因為這項貢獻 1946年被授予諾貝爾獎，這是病毒學領域第一個獲此殊榮的科學家；1938年W.J.Elford測定了各種病毒顆粒大小； 19

4、39年，G.A.Kansche在電鏡下直接觀察到TMV ；1955年，Scaffer和Schwerdt成功結(jié)晶了脊髓灰質(zhì)炎病毒，這是第一個被結(jié)晶出來的動物病毒；等等。這一階段，病毒學工作者主要采用敏感動物（如小白鼠）或動物胚胎（如雞胚）來研究病毒，分離鑒定了近百種病毒。同時在機體水平上研究了病毒的繁殖、發(fā)病機理和免疫反應等。只是微生物學的一個分支。,病毒的細胞水平研究時期,利用大腸桿菌研究噬菌體的感染過程取得了迅速發(fā)展組織培養(yǎng)技術(shù)

5、開始應用于動物病毒的研究 我國學者黃禎祥早在1943年就利用雞胚組織塊在試管內(nèi)進行病毒傳代、定量滴定及中和試驗。 組織培養(yǎng)技術(shù)對動物病毒研究所作的貢獻主要包括：病毒轉(zhuǎn)錄新途徑和翻譯新途徑的發(fā)現(xiàn)；病毒對宿主范圍的選擇；某些腫瘤病毒引起的細胞轉(zhuǎn)化；某些病毒侵染引起的細胞融合；發(fā)現(xiàn)有的病毒核酸由若干片段組成；有的病毒核酸具有極性的不同，如小RNA病毒為正鏈RNA病毒，正粘病毒為負鏈RNA病毒。 植物病毒不斷有重要的發(fā)現(xiàn)

6、 此階段，病毒學逐步形成了一門獨立的學科。,分子病毒學的研究時期,自從1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論建立以來，由于分子生物學的迅速發(fā)展，使病毒學的研究步入了分子病毒學的發(fā)展時期，分子病毒學也正是分子生物學的發(fā)展過程中應運而生。分子病毒學的發(fā)展是各相關(guān)學科如分子生物學、細胞生物學、遺傳學、免疫學與病毒學理論和技術(shù)相互滲透的結(jié)果。尤其是分子生物學新技術(shù)的發(fā)明極大剌激了分子病毒學的發(fā)展。,分子病毒學的研究時期的研究成果（一）,分子病毒

7、學的研究時期的研究成果（二）,病毒感染性疾病,肝炎病毒（Hepatitis Virus）人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）人乳頭瘤狀病毒（human papillomavirus , HPV ）EB病毒（Ebstein-Barr Virus, EBV）SARS冠狀病毒(SARS-associated coronavirus, SARS-CoV)甲型H1N1流感病毒（Influe

8、nza A(H1N1) virus ）手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,肝炎病毒（Hepatitis Virus）,引起肝炎的病毒有多種類型，包括甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus,

9、HDV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)等，分別能夠引起甲型、乙型、丙型、丁型、戊型5種肝炎癥狀。近年又發(fā)現(xiàn)有己型肝炎（HFV引起）和庚型肝炎(HGV引起)出現(xiàn)。,（一） 乙型肝炎病毒,結(jié)構(gòu)和特點：HBsAg：是HBV感染的主要標志HBsAb：保護性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細胞核內(nèi)，　　　　一般不存在于血循環(huán)中HBcAb: 非保護性抗體，HBcAb-IgM　　　　提示HBV處于復制狀

10、態(tài)HBeAg：HBV復制及強感染性的指標HBeAb：有一定的保護作用，預后良好,HBV感染的診斷ELISA方法，但只能提供血清中的HBV間接證據(jù)，無法證明是否具有傳染性檢測血清標本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（兩對半）：比較簡單，而且敏感性較低。內(nèi)源性DNA聚合酶法和斑點雜交分析法：可直接確定臨床標本中HBV DNA的存在。比較敏感，能檢測到0.1pg的HBV DNA。 熒光定量PC

11、R方法：可檢測到200copy/ml的HBV DNA。 可 檢出雜交法測定陰性而具有不同HBV血清學標志的血清標本中的 HBV DNA?？蓹z出HBs Ag陽性而Hbe Ag陰性攜帶者的HBV DNA。 可檢出慢性HBV感染α-干擾素治療后轉(zhuǎn)陰的患者血清中殘存的HBV DNA。,（一） 乙型肝炎病毒,應用核酸擴增技術(shù)(NAT)是降低HBV殘留危險性的重要策略,病毒特點： 1. 單

12、正鏈RNA病毒 2. E1和E2區(qū)基因高度變異性,（二）丙型肝炎病毒,感染特點：HCV在血中含量極微 輸血后肝炎主要致病因子免疫學標志僅有抗-HCV，非中和抗體，產(chǎn)生時間不一有一部分人感染HCV后，不產(chǎn)生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%)疫苗研制尚不成功,單鏈RNA,,HCV的流行病學,全世界的感染人群約有1.7億75% HCV感染發(fā)展成慢性HCV感染發(fā)展成有癥狀的肝病需要十年以上可引起慢性肝炎、肝硬化、肝細

13、胞癌通過輸血、靜脈用藥傳播血清中出現(xiàn)HCV抗體在感染后54－192天,ELISA方法檢測HCV抗體：篩查試驗 RIBA：確證試驗 HCV RNA檢測：確證試驗,HCV感染的診斷,抗HCV篩查及確認試驗結(jié)果的解釋,HCV-RNA定量檢測的臨床意義 早期診斷： HCV感染1-3W，即可檢出HCV-RNA的存在。 HCV-RNA載量與抗-HCV滴度、ALT水平之間的相關(guān)性：抗-HCV滴 度和ALT異

14、常率隨著HCV-RNA載量升高而增加。 HCV-RNA是評價抗病毒治療效果的重要指標。 慢性丙型肝炎長期抗-HCV陽性，這時如果進行HCV-RNA 定量檢測 可以鑒別活動性、復制程度。,人類免疫缺陷病毒(HIV),1982年發(fā)現(xiàn)第1例經(jīng)輸血傳播HIV1985年開始檢測血液和血液制品還可通過母嬰垂直傳播和性接觸傳播可變的潛伏期普遍的癥狀包括夜汗、體重下降、 腹瀉、鵝口瘡、紫癜慢性感染，但多種藥物治療可降

15、低病毒滴度,人類免疫缺陷病毒(HIV),艾滋病有三個特性： 獲得性---艾滋病并非先天具有，而是后天獲得。 免疫缺陷---AIDS的發(fā)病機理在于，HIV通過造成人體免疫系 統(tǒng)的損傷，進而導致免疫系統(tǒng)防護功能的減低甚至喪失。 綜合癥---在臨床癥狀方面，由于免疫缺陷導致的各個系統(tǒng)的 機會性感染、腫瘤而出現(xiàn)復雜的伴隨癥狀群。,人類免疫缺陷病毒(HIV),HIV, the virus that causes

16、AIDS, is shown budding out of a human immune cell.,人類免疫缺陷病毒(HIV),HIV病毒：多亞型和多變異HIV-1和HIV-2M組、O組和N組亞型：A-KCRF：基因重組亞型，主要是HIV-1型毒株亞型監(jiān)測的意義 不同亞型與不同傳播途徑的關(guān)系：B主要通過男性同性性行為和靜脈注射吸毒傳播，C主要異性性接觸傳播 流行地理和傳播線路的分析：東南亞區(qū)域的C亞型和B亞

17、型 重組亞型傳播效力變化及對流行的影響：東歐的B/A重組流行、泰國的A/E重組,HIV在外界的抵抗力HIV病毒一旦離開宿主細胞在外界環(huán)境中生存能力很快消失HIV對環(huán)境中的物理因素和化學因素抵抗力均較弱，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多對HBV有效得消毒和滅活方法均適用于HIV,人類免疫缺陷病毒(HIV),,HIV感染的三種結(jié)局典型進展者：8-10年潛伏期后成為艾滋病人，80% -90%快速進展者：CD4細胞

18、2-5年內(nèi)迅速下降，HIV病毒載量一直維持較高水平，而且分離的HIV有均一性。長期存活者（又稱長期不進展者）：維持15年以上，而且CD4計數(shù)維持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。,人類免疫缺陷病毒(HIV),,HIV感染的三種結(jié)局典型進展者：8-10年潛伏期后成為艾滋病人，80% -90%快速進展者：CD4細胞2-5年內(nèi)迅速下降，HIV病毒載量一直維持較高水平，而且分離的HIV有均一性。長期存活者（又稱長期不進展者）：

19、維持15年以上，而且CD4計數(shù)維持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。,人類免疫缺陷病毒(HIV),,HIV抗體的檢測P24抗原的檢測HIV 核酸檢測,HIV感染的實驗室診斷,,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)明膠凝集試驗各種快速診斷試劑檢測亞型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亞型，窗口期由10周縮短至3～4周。,HIV抗體的檢測,,HIV抗體的檢測 按《規(guī)范》要求，我國采供血機構(gòu)進行血液篩查和各醫(yī)

20、療衛(wèi)生機構(gòu)常規(guī)篩查檢測宜采用ELISA法。對用ELISA試劑或快速診斷試劑進行的篩查實驗如呈陰性反應，即報告HIV抗體陰性；對呈陽性反應的標本，篩查實驗室應用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑進行重復檢測，如兩種試劑復測均呈陰性反應，則報告HIV抗體陰性；如均呈陽性反應，或一陰一陽，需送艾滋病確認實驗室進行確認。篩查試劑必須是HIV-1/2混合型、經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局(SDA)注冊批準、批檢合格、臨床評估質(zhì)量優(yōu)良、在有效期內(nèi)的試

21、劑。,人類免疫缺陷病毒(HIV),,免疫印跡試驗條帶免疫試驗免疫熒光試驗,HIV確認試驗,,ELISA雙抗體夾心法 陽性結(jié)果必須經(jīng)中和試驗確認，該結(jié)果才可作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)。HIV-1 P24抗原檢測陰性，只表示在本試驗中無反應，不能排除HIV感染。 在窗口期檢測P24抗原是早期輔助診斷和進一步縮短窗口期的一種方法，還可用于HIV陽性母親所生嬰兒的早期輔助鑒別診斷。,P24抗原的檢測,,檢測HIV RNA

22、通常使用PCR或RT-PCR技術(shù)， 核酸序列擴增實驗(NASBA)、分支DNA雜交實驗等 注意： HIV核酸定性檢測陰性，只可報告本次實驗結(jié)果陰性，但不能排除HIV感染；HIV核酸檢測陽性，可作為診斷HIV感染的輔助指標，不能單獨用于HIV感染的診斷，報告定性檢測結(jié)果時還應注明反應條件和所使用的引物序列。報告HIV核酸定量檢測結(jié)果時應按照儀器讀數(shù)報告結(jié)果，注明使用的試驗方法、樣品種類和樣品量，當測定結(jié)果小于最低檢測限時，應注

23、明最低檢測限水平，低于最低檢測限的結(jié)果不能排除HIV感染。,HIV核酸檢測,,CD4+T淋巴細胞計數(shù)血漿HIV RNA水平(病毒載量) 這兩項實驗可以為臨床醫(yī)生提供病人病毒水平、免疫狀態(tài)的相關(guān)資料，是預測疾病進程的可靠指標，還可獨立預測艾滋病臨床過程和生存期。,HIV感染的實驗室監(jiān)測,,流式細胞儀是檢測CD4+T淋巴細胞計數(shù)的標準方法，可以得出CD4+T細胞占淋巴細胞的比值及絕對值。CD4+T細胞計數(shù)是艾滋病診斷、疾病分期的實

24、驗室標準指標。,CD4+T淋巴細胞計數(shù),,HIV病毒耐藥分為原發(fā)性(Primary)及繼發(fā)性(Secondary) 原發(fā)性HIV病毒耐藥：指那些直接影響抗病毒藥物作用靶點的變異，具有藥物特異性，可降低抗病毒藥物敏感性 繼發(fā)性變異又稱為補償變異：常出現(xiàn)于原發(fā)性變異已存在的病毒基因組中，原發(fā)性變異可造成復制關(guān)鍵酶的改變，導致病毒動力學的不利，繼發(fā)性變異可糾正由原發(fā)性變異導致的不利，提高病毒的耐藥性，對原發(fā)性變異起到保護和促進作用,HIV

25、抗病毒治療的耐藥監(jiān)測,,耐藥性檢測有兩種方法 表型檢測：通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進行基因型檢測：通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關(guān)的病毒基因突變基因型檢測的費用較低，較容易，可在樣品收集后1～2周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關(guān)知識，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對結(jié)果進行正確的分析。表型檢測可以直接檢測病毒的耐藥性，但操作復雜、耗時，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前國際上廣泛應用于臨床的是基因型耐

26、藥檢測。,人乳頭瘤狀病毒（human papillomavirus, HPV ）,HPV具有宿主和組織特異性，只能感染人的皮膚和黏膜上皮細胞，人是HPV的惟一宿主。有100多個型低危型：HPV 6、11引起良性病變 (尖銳濕疣、喉乳頭瘤等)高危型：HPV 16、18引起惡性腫瘤 (宮頸癌、肛門癌、口腔癌等)新生兒產(chǎn)道感染。免疫原性低，易形成持續(xù)性感染。,高危型 16.18.31.33.35.39.45.51.52.56

27、.58.59. 68.73.82.亞型CP8304 可能高危型 26.66.53低危型 6.11.40.42.43.44.54.61.70.72.81.cp6108,HPV型別,HPV中國型別分布,烏蘭娜,吳瑞芳等，人乳頭瘤病毒基因亞型與宮頸病變的關(guān)系,中國婦產(chǎn)科臨床雜志,Major capsid protein,Transforming genes/growth stimulation,Minor capsid

28、 protein,Regulation of viral replication,Regulation of viral transcription & replication,URR,HPV,2001年在歐洲由德國、法國和英國聯(lián)合對二代雜交捕獲HC2 HPV檢測在宮頸癌篩查中的作用進行了大規(guī)模的研究和評估K.U. Petry, C. Clavel, A. Szarewski, T.Iftner, P.Birembaut,

29、 J.Cuzick,,,23,890 (篩查人數(shù)）,,21,409,,HPV-細胞學-,,,,488,HPV-細胞學+,,,1370,HPV+細胞學-,,,523,,陰道鏡檢查533無病例 發(fā)現(xiàn),,,,,,,,,,只發(fā)現(xiàn)3個病例,發(fā)現(xiàn)59個病例,發(fā)現(xiàn)144個病例,HPV+細胞學+,,,HC2 與巴氏涂片對檢測CIN2或以上的病變的敏感度比較,各地區(qū)細胞學與HPV敏感度結(jié)果比較篩查,,“HPV相比其它所有的宮頸癌篩查方法

30、重復性更好，是值得信賴的、可靠的宮頸癌初篩新方法?！?,HPV-DNA分型檢測的意義 ：監(jiān)測子宮頸上皮內(nèi)高度病變區(qū)分患者患宮頸癌的危險度篩查宮頸細胞低度病變（ASCUS或CINI）中潛在的宮頸癌高?；颊哂糜谑中g(shù)后追蹤以確定是否將病灶清除干凈用于治療后的隨訪指導HPV疫苗的研究及使用評估治療療效,,EB病毒,1964年名Esptein-Barr 首先發(fā)現(xiàn)、命名1966年Old等首先證實EB病毒和鼻咽癌的血清學關(guān)系196

31、8年Henle等證明該病毒是傳染性單核細胞增多癥的病原體,EB病毒特異性抗原,病毒潛伏感染時表達的抗原： EB病毒核抗原（EBNA） EB病毒潛伏感染膜抗原（EBLMP）病毒增殖感染相關(guān)抗原： EB病毒特異性抗原EB病毒早期抗原（EA） EB病毒衣殼抗原（VCA） EB病毒膜抗原（MA）,EBV感染時主要抗病毒抗體產(chǎn)生的模式,SARS冠狀病毒,一種新的烈性呼吸道傳染病。疾病的病原體（SARS冠

32、狀病毒；SARA-CoV）。SARS為全身損傷性疾病，尤以肺組織、免疫組織及小靜脈為主。SARS的臨床診斷標準明確，實驗室的輔助手段是抗-SARA-CoV IgM的檢測和病毒的核酸分析。,,甲型H1N1流感病毒,甲型流感病毒根據(jù)其表面(H和N)結(jié)構(gòu)及其基因特性的不同又可分成許多亞型，至今甲型流感病毒已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個亞型(H1-H16)，神經(jīng)氨酸酶9個亞型(N1-N9)。,世界衛(wèi)生組織2009年4月30日宣布，從當日起，該組織不

33、再使用“豬流感”一詞，而開始使用“A（H1N1）型流感”一詞。與之相對應，我國的官方文件從5月1日起相繼用“甲型H1N1流感”代替原來的“人感染豬流感”。,甲型H1N1流感,甲型H1N1流感病毒屬于正粘病毒科，典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80 nm~120 nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA 和M2蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼, 呈螺旋狀對稱, 直徑為10nm。甲型H1N1流感病毒為單股負鏈RN

34、A 病毒，基因組約為13.6 kb，由大小不等的8 個獨立片段組成。,甲型H1N1流感,甲型H1N1流感,流行病學特點傳染源 主要為病豬和攜帶病毒的豬，感染豬流感病毒的人也被證實可以傳播病毒。感染這種病毒的動物均可傳播。傳播途徑 主要為呼吸道傳播，也可通過接觸感染的豬或其糞便、周圍污染的環(huán)境或氣溶膠等途徑傳播。某些毒株如H1N1可在人與人之間傳播，其傳染途徑與流感類似，通常是通過感染者咳嗽或打噴嚏等。易感人群

35、普遍易感?；颊叨鄶?shù)年齡在25歲至45歲之間，目前報道以青壯年為主，應注意老人和兒童。,甲型H1N1流感,實驗室檢查外周血象：白細胞總數(shù)一般不高或降低。重癥患者多有白細胞總數(shù)及淋巴細胞減少，并有血小板降低；血清學診斷：可使用間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免疫法等；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）：由于PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏、特異性強等特點，已用于豬流感病毒基因的檢測和分子流行病學調(diào)查等；病毒分離：從患者呼吸

36、道標本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或氣管吸出物、痰或肺組織）分離甲型H1N1流感病毒。常用的方法有雞胚接種法和細胞培養(yǎng)法?，F(xiàn)有的診斷方法中，病毒分離法是較敏感的，但需要2-3周時間。,甲型H1N1流感,1957年在加拿大首次報告，新西蘭Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson從患者糞便和咽拭中分離出CoxA16，同時患者血清抗體有四倍增長,初步查明CoxA16為本病病原；1959年提出HFMD命名，HFM

37、D在全球廣泛流行，無明顯的地域分布。之后世界各地均經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、埃可病毒和EV 71引起的手足口病流行。發(fā)熱, 不適, 咽喉腫痛, 口腔、手、腳側(cè)面及掌心、屁股出現(xiàn)小泡傳染性極高病程約1周,手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,手足口病可由多種腸道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯薩奇B組病毒, 以CoxA1

38、6 和 EV71最為常見 傳播途徑: 糞-口途徑傳播: 唾液與糞便; 呼吸道傳播: 空氣飛沫; 接觸傳播 皰疹液中含大量病毒，皰疹破潰后病毒排出。 HFMD為全球性傳染病，在全球廣泛分布，無明顯的地域分布, 但 近年EV71在東南亞一帶流行, 引起較多的重癥和死亡病例。在80年代和90年代，中國手足口病的流行主要以 CoxA16為主， 2008年，CoxA16 和EV71 共循環(huán)引起手足口病爆發(fā), EV71在大

39、部分省市為優(yōu)勢病毒。,手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,66,患者年齡分布,手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,人腸道病毒感染的一般致病機制,,致病特點隱性感染多見，很少引起腹瀉，嬰幼兒、免疫力低下的成人易感。 病毒在機體腸道中增殖，很少引起腸道癥狀，是以消化道為原發(fā)灶的全身感染。不同人腸道病毒可引起相同癥狀，同一種人腸道病毒

40、可引起不同臨床表現(xiàn)。感染過程中形成病毒血癥。,中國HFMD的流行1981年，我國在上海首次報道了HFMD病例1987年在中國分離到CVA161995年以來，我國陸續(xù)在武漢、深圳、上海、重慶、山東和安徽等地的HFMD患者中分離到EV71病毒。 2007年，山東發(fā)生了手足口病爆發(fā)流行，累計報告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。實驗室檢測發(fā)現(xiàn)EV71是引起山東臨沂HFMD的主要病原，同時還檢測到Echo3 和/或