實驗性癲癇發(fā)作后海馬結(jié)構(gòu)GABAB受體亞單位表達(dá)變化及其激動劑影響的研究.pdf

1、本文對海人酸(KA)誘導(dǎo)大鼠顳葉EP發(fā)作后海馬結(jié)構(gòu)2種GABAB-R亞單位即GBRla和GBR2的變化進(jìn)行探討，以了解顳葉EP上GABAB-R亞單位作用和可能的適應(yīng)性變化，為進(jìn)一步明確顳葉EP發(fā)病的受體分子生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 一、腦內(nèi)局部給藥建立海人酸顳葉癲癇模型的研究。 目的：探討腦內(nèi)局部給藥建立顳葉EP模型方法，為以后的顳葉EP研究奠定基礎(chǔ)。 方法：通過立體定向技術(shù)向大鼠海馬局部注射海人酸4p．1／kg，觀

2、察注射后大鼠的行為學(xué)、腦電圖和病理學(xué)改變。 結(jié)果：KA注入海馬后大鼠表現(xiàn)為凝視、濕狗樣抖動、咀嚼運動、點頭、肢體陣攣等；隨后出現(xiàn)陣發(fā)性旋轉(zhuǎn)、向上竄跳、四肢抽搐，反復(fù)間歇發(fā)作約lOh后發(fā)作停止。以后每周約自發(fā)性發(fā)作1-3次，主要為II級~IV級；同時，EP發(fā)作后大鼠防衛(wèi)反應(yīng)級別高，存在明顯的易激惹表現(xiàn)。EEG記錄到大腦皮質(zhì)叢集放電，棘波或尖波持續(xù)發(fā)放。病理形態(tài)學(xué)上觀察到KA注射側(cè)海馬結(jié)構(gòu)普遍受損，以CA3區(qū)最嚴(yán)重，齒狀回(DG)最

3、輕。KA注射對側(cè)神經(jīng)元受損明顯輕于KA注射側(cè)，存在明顯單側(cè)病灶的病理改變。 結(jié)論：大鼠腦內(nèi)局部注射ICA可成功建立顳葉EP模型，其行為癥狀、電生理及海馬病理學(xué)改變類似人類顳葉EP，且化學(xué)點燃成功率高，重復(fù)性好，局部給藥較系統(tǒng)給藥具有許多優(yōu)點，是研究顳葉EP發(fā)病機(jī)制及篩選抗癇藥的理想模型。 二、GABAB受體亞單位在顳葉癲癇大鼠海馬結(jié)構(gòu)的表達(dá)變化。 目的：探討KA顳葉EP發(fā)作后2種GABAB-R亞單位即GBRla和

4、GBR2的動態(tài)變化，以進(jìn)一步了解顳葉EP發(fā)病的受體分子生物學(xué)機(jī)制。同時，探討GABAs-R激動劑巴氯芬(baclofen，BLF)對顳葉EP海馬結(jié)構(gòu)GABAB-R亞單位的作用及其意義，為篩選作用于該類亞單位水平的新型抗癇藥提供依據(jù)。 方法：在腦內(nèi)局部注射KA建立顳葉EP模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用原位雜交技術(shù)，在基因水平上，檢測海馬結(jié)構(gòu)各亞區(qū)、不同時程的2種亞單位mRNA表達(dá)及其單個殘存細(xì)胞mRNA表達(dá)的變化；應(yīng)用免疫組化分析方法，在蛋白

5、水平上，檢測海馬結(jié)構(gòu)各亞區(qū)及顳葉皮層不同時程的2種亞單位表達(dá)的變化；同時，應(yīng)用原位雜交技術(shù)，檢測GABAB-R激動劑BLF干預(yù)后2種亞單位基因表達(dá)的變化。 結(jié)果： (1)KA注射側(cè)海馬結(jié)構(gòu)殘存細(xì)胞明顯減少，以CA3區(qū)細(xì)胞缺失最多，致癇7d時缺失量已大于85％，且膠質(zhì)細(xì)胞增多：其次以CAl區(qū)神經(jīng)元缺失明顯，致癇7d后缺失量在50％以上：DG區(qū)細(xì)胞缺失量最少，此外，KA注射側(cè)殘存細(xì)胞數(shù)明顯少于ICA注射對側(cè)，顯示了KA注射側(cè)

6、明顯的單側(cè)病灶。隨著時間的推移，致癇組病理改變逐漸加重，注射側(cè)殘存正常細(xì)胞進(jìn)一步減少。 (2)ICA致癇早期(6h-12h)，2種單位mRNA表達(dá)水平廣泛下降，以后CAI和CA3區(qū)表達(dá)持續(xù)低下，但有逐漸表達(dá)增加的趨勢：DG區(qū)表達(dá)暫時性下降后很快回升；單個殘存正常細(xì)胞數(shù)的亞單位mRNA表達(dá)則明顯增加，尤其CA3區(qū)2種亞單位表達(dá)水平上調(diào)明顯。 (3)ICA致癇早期海馬結(jié)構(gòu)2種亞單位免疫反應(yīng)未見明顯改變，隨后CAl和CA3區(qū)逐

7、漸表達(dá)下降而處于表達(dá)低水平，與神經(jīng)元變性一致。DG區(qū)和顳葉皮層的2種亞單位表達(dá)很快恢復(fù)且增加明顯。此外，2種亞單位蛋白表達(dá)變化基本一致，但與其對應(yīng)的mRNA表達(dá)不完全同步。 (4)BLF干預(yù)后使2種亞單位表達(dá)明顯下降的時間點延遲，且表達(dá)下降幅度小于非干預(yù)的致癇組；在CAI與CA3區(qū)2種亞單位表達(dá)下降最明顯時，干預(yù)組表達(dá)水平明顯高于非干預(yù)的致癇組。 結(jié)論： (1)KA注射側(cè)海馬結(jié)構(gòu)殘存正常細(xì)胞數(shù)普遍減少，且明顯少于

8、KA注射對側(cè)，這種明顯單側(cè)病灶的病理改變比系統(tǒng)給藥建立的雙側(cè)同等程度損害的EP模型更接近人類顳葉EP。隨著時間的推移，致病組殘存正常細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少，提示EP早期抗損傷的腦保護(hù)治療不僅有利于挽救受損的神經(jīng)元，而且有利于控制EP發(fā)作，應(yīng)具有十分重要意義。 (2)KA致癇后CAl和CA3區(qū)2種亞單位mRNA表達(dá)持續(xù)低下，早期為GABA活性降低，客觀上促進(jìn)了EP的產(chǎn)生及擴(kuò)展，隨后的持續(xù)性下降為KA很強(qiáng)的神經(jīng)損害致海馬區(qū)神經(jīng)元缺失所致；

9、糾正海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元缺失后，單個殘存正常細(xì)胞數(shù)的mRNA表達(dá)明顯增加，尤其CA3區(qū)。這種亞單位表達(dá)水平的上調(diào)，可增強(qiáng)突觸前谷氨酸能神經(jīng)元異源受體即GABAB-R的功能(減少谷氨酸釋放)及突觸后膜抑制功能，以彌補(bǔ)該區(qū)神經(jīng)元缺失所致的GABAB-R介導(dǎo)的功能缺失，此可能為顳葉EP的內(nèi)源性自我保護(hù)機(jī)制。 (3)2種亞單位免疫反應(yīng)的改變提示了機(jī)體對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)過度興奮的適應(yīng)性反應(yīng)。此外，2種亞單位蛋白表達(dá)與其對應(yīng)的mRNA表達(dá)不完全同步，提示