舞毒蛾G蛋白偶聯(lián)受體功能鑒定及對(duì)殺蟲劑脅迫響應(yīng)機(jī)制.pdf

1、舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)是世界性的害蟲之一，分布廣，食性雜，主要危害葉片造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，舞毒蛾防治主要依賴于化學(xué)殺蟲劑，高頻率的使用化學(xué)殺蟲劑易使舞毒蛾產(chǎn)生抗藥性。因此，尋找新的分子作用靶標(biāo)來創(chuàng)制新型殺蟲劑迫在眉睫。參與昆蟲機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、營(yíng)養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)等重要功能的基因產(chǎn)物往往是理想的作用靶標(biāo)。昆蟲G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)參與重要的生

2、理功能和內(nèi)源、外源化合物的響應(yīng)而受到廣泛的關(guān)注，探討GPCR超級(jí)家族重要基因功能對(duì)于明確昆蟲生理和篩選新的殺蟲劑作用靶標(biāo)具有非常重要的意義。
　　為了深入研究昆蟲GPCRs成為殺蟲劑新作用靶標(biāo)的可能性，本研究以林果重要害蟲舞毒蛾(L.dispar)為對(duì)象，首先利用高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了新型魚丁尼受體抑制劑溴氰蟲酰胺亞致死劑量處理和對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組，比較分析了差異表達(dá)基因，在此基礎(chǔ)上篩選出舞毒蛾GPCRs家族基因，并重點(diǎn)分析GPCR基因

3、功能(OA1、Mth1、Mth2)及對(duì)殺蟲劑脅迫響應(yīng)機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1、分別構(gòu)建溴氰蟲酰胺(LC20=0.187mg/L)和對(duì)照（丙酮）處理舞毒蛾2齡幼蟲轉(zhuǎn)錄組文庫，獲得26.31 Gb數(shù)據(jù)，其中Q30堿基百分比在87.30％以上，共獲得40830條Unigene，長(zhǎng)度大于1kb為9529條;其分別注釋到Nr、SwissProt、KEGG、COG和GO蛋白庫的Unigene個(gè)數(shù)為18199條、10532條、4826條

4、、4861條和10133條;共獲得18260條unigene功能基因。
　　2、基于舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，搜索、鑒定出27條舞毒蛾GPCRs基因。采用RT-qPCR法分析其中18個(gè)GPCRs基因?qū)︿迩杈挣?、氧化樂果、甲萘威和溴氰蟲酰胺脅迫響應(yīng)，結(jié)果表明:在溴氰菊酯脅迫下，Unigene21812、Unigene32849、Unigene40527、Unigene42365、Unigene47827、Unigene48286、Unig

5、ene15819主要以上調(diào)表達(dá)為主，其余表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá);甲萘威脅迫下，Unigene39352、CL3275.Contig1、Unigene40527、Unigene42365、Unigene47827、Unigene48286、Unigene15819主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá);氧化樂果脅迫下8個(gè)GPCRs基因(Unigene44172、Unigene46527、Unigene46885、CL8307.Contig1、Unigene5315、

6、Unigene9775、Unigene11368、Unigene15505)下調(diào)表達(dá)，10個(gè)基因(Unigene21812、Unigene32849、Unigene39352、CL3275.Contig1、Unigene40527、Unigene42365、Unigene47827、Unigene48286、Unigene4933、Unigene15819)上調(diào)表達(dá);而在溴氰蟲酰胺脅迫下，14個(gè)GPCRs基因主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，這些結(jié)果

7、表明GPCRs可能參與了殺蟲劑的脅迫應(yīng)答。本文克隆獲得了3個(gè)GPCRs基因(Unigene44172、Unigene46527和Unigene46885)全長(zhǎng)序列，蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)分屬于GPCR家族中眼白化?、裥偷鞍谆?LdOA1)、長(zhǎng)壽蛋白家族基因(LdMth1、LdMth2)。開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為453～1563bp，編碼150～520個(gè)氨基酸，蛋白分子量為17.54～59.18kDa，pI為9.76～10.07，均為堿性蛋白

8、。
　　3、采用RT-qPCR法分析LdOA1、LdMth1和LdMth2基因發(fā)育表達(dá)特異性，結(jié)果顯示:舞毒蛾各個(gè)發(fā)育階段3個(gè)GPCRs基因均有表達(dá)，且在卵期呈現(xiàn)高表達(dá)。LdOA1和LdMth1基因分別在雄性和雌性成蟲轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最大，這表明LdOA1、LdMth1和LdMth2基因表達(dá)具有發(fā)育特異性。
　　4、RNAi技術(shù)將LdOA1、LdMth1、LdMth2基因特異的dsRNA微注射入舞毒蛾幼蟲體內(nèi)獲得基因沉默舞毒蛾，

9、測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平及其營(yíng)養(yǎng)利用指標(biāo)。結(jié)果顯示:LdOA1和LdMth2基因均在120 h時(shí)，沉默效果最佳，沉默效率分別為95.18％和82.00％，顯著高于對(duì)照組GFP的沉默效果;LdMth1基因除24 h和48 h外，其余各時(shí)間點(diǎn)沉默效果明顯，96 h的沉默效率高達(dá)97.96％。與微量注射LdOA1、LdMth1基因處理組與對(duì)照組ddH2O和GFP相比，正常飼喂8d后，在取食、體型及食物利用率上差異不顯著;相對(duì)取食量分

10、別低于對(duì)照組(dsRNAGFP)7.19％和1.83％，引起舞毒蛾幼蟲的正常發(fā)育，但未出現(xiàn)顯著的幼蟲死亡現(xiàn)象。生物測(cè)定基因沉默舞毒蛾對(duì)殺蟲劑敏感性結(jié)果表明，目的基因被沉默后導(dǎo)致其對(duì)殺蟲劑的敏感性顯著提高。在溴氰菊酯敏感性研究中發(fā)現(xiàn)120 h內(nèi)dsRNALdOA1、ds RNA LdMth1和dsRNALdMth2處理組的死亡率與對(duì)照(dsRNAGFP)組相比，舞毒蛾幼蟲的死亡率分別提高了20.42％、39.20％、48.30％; LdO

11、A1、LdMth1和LdMth2的轉(zhuǎn)錄水平抑制率分別為98.53％、99.85％、99.85％;而與dsRNAGFP對(duì)照組相比，dsRNALdOA1、dsRNALdMth1、dsRNALdMth2處理組幼蟲對(duì)溴氰蟲酰胺敏感性依次提高了15.96％、56.67％、8.49％。
　　5、成功將LdOA1、LdMth1、LdMth2基因微注射入果蠅2＃和3#染色體，分別獲得6個(gè)轉(zhuǎn)基因果蠅品系(命名為:attp2#-LdOA1、attp3

12、#-LdO A1、attp2#-LdMth1和attp3#-LdMth1、attp2#-LdMth1和attp3#-LdMth2)。與背景果蠅相比，轉(zhuǎn)基因果蠅品系的平均壽命延長(zhǎng)為51.03％～69.89％。轉(zhuǎn)基因果蠅對(duì)殺蟲劑敏感性測(cè)定顯示:attp2#-LdOA1、attp3#-LdOA1、attp2#-LdMth1和attp2#-LdMth2的果蠅品系對(duì)溴氰菊酯敏感，而attp3#-LdMth1、attp3#-LdMth2果蠅品系對(duì)溴

13、氰菊酯的耐藥性有所提高，抗性比分別為1.65和1.50倍;為了研究表達(dá)舞毒蛾GPCR基因果蠅下游基因?qū)⑾x劑的響應(yīng)，本文采用RT-qPCR技術(shù)測(cè)定了低濃度溴氰菊酯脅迫下轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)HSP、GST、CYP基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示:Mth基因調(diào)控GST家族響應(yīng)溴氰菊酯的脅迫，轉(zhuǎn)錄水平依次為非轉(zhuǎn)基因果蠅品系的1.09～17912.35倍(attp2#-LdMth1)、1.10～2155.29倍(attp3#-LdMth1)、1.30～647.

14、17倍(attp2#-LdMth2)、1.25～1646.67倍(attp3#-LdMth2)，而CYP6a8、CYP6a9、CYP4e2、hsp23、hsp26、hsc70-5(attp2#-LdMth1和attp2#-LdMth2)為上調(diào)表達(dá)，CYP6w1、hsp22、hsp26、hsc70-3主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)(attp3#-LdMth1和attp3#-LdMth2);3#染色體表達(dá)LdOA1基因果蠅品系CYP、HSP、GST家族