松鼠葡萄球菌mecA和金黃色葡萄球菌mecA在松鼠葡萄球菌耐藥機制及細胞壁合成中的作用.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院內獲得性感染和社區(qū)獲得性感染的重要致病菌之一。β-內酰胺類抗生素曾經是治療金黃色葡萄球菌感染的有效武器，但隨著耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus attreus，MRSA)分離率的逐漸增加，金黃色葡萄球菌引起的感染成為臨床上非常棘手的問題。耐藥的主要決定基因為 mecA。mecA編碼的青霉素結合蛋白2A(penicillin-bindingprot

2、ein 2A，PBP2A) 對β-內酰胺類抗生素親和力很低，當固有的PBP被β-內酰胺類抗生素飽和時，PBP2A可替代這些PBPs的轉肽功能催化細胞壁合成。mecA基因并非金黃色葡萄球菌的固有基因，而是一外源基因，其來源有很多假設，目前認為是從松鼠葡萄球菌中獲得。大多數(shù)松鼠葡萄球菌的mecA并不提供抗藥性，但把活化的松鼠葡萄球菌mecA引入到敏感的金黃色葡萄球菌可使后者的抗藥性大大增加，松鼠葡萄球菌的mecA基因產物能夠利用金黃色葡萄球

3、菌的細胞壁前體合成金黃色葡萄球菌的細胞壁。最近，我們分離到了既含有松鼠葡萄球菌的mecA又含有金黃色葡萄球菌的mecA的松鼠葡萄球菌K3，K3為黃色菌落，在沒有抗生素存在時能自發(fā)分化為K3y(黃色菌落)和K3w (白色菌落)。前者表型和基因型與親代菌完全相同，后者僅含有松鼠葡萄球菌mecA而丟失了金黃色葡萄球菌的mecA。本論文將針對這兩個mecA基因在松鼠葡萄球菌的耐藥性及細胞壁合成中的作用進行研究。 目的：進一步研究松鼠葡萄

4、球菌的生物學特征和基因特征以期更深入的理解金黃色葡萄球菌耐藥性基因mecA來源以及MRSA菌株的耐藥機制：同時，認識臨床上分離率日益增加的松鼠葡萄球菌的耐藥機制。 方法：通過抗生素壓力選擇出松鼠葡萄球菌K3的高度均一耐藥株；應用E-test和PAP 試驗來檢測松鼠葡萄球菌對苯唑西林的耐藥性；PCR擴增兩個mecA基因并制備DNA探針；多重PCR 用于菌株K3和K8的SCCmec 分型；應用 Northem blot 和 West

5、ern blot分別檢測兩個mecA基因在轉錄水平和蛋白質水平上的表達；通過克隆和測序排布出敏感菌 K1 及耐藥菌K3 orfX 區(qū)的基因分布，與GenBank中的同源序列進行比較并分析其特征；Sma I消化染色體DNA后，脈沖場電泳分離消化產物，Southem blot檢測orfX和mecA在染色體上的位置關系；分離、純化細菌膜蛋白后應用PBP assay鑒定出松鼠葡萄球菌的青霉素結合蛋白圖譜以及各個PBPs對β-內酰胺類抗生素的親和

6、力；分離、純化細胞壁，高壓液相法分析細胞壁成分。 結果：經過抗生素選擇壓力，篩選出 K3 的 homo<'*> 衍生菌 K3HO，K3HW。K3HWO。K3 對苯唑西林呈異質性耐藥，K3 homo<'*> 衍生菌對苯唑西林高度均一耐藥，MIC>400μg/ml。在抗生素存在的情況下，K3自發(fā)分化為K3w和K3y的現(xiàn)象被抑制，分化出的黃，白菌落均含有松鼠葡萄球菌mecA和金黃色葡萄球菌mecA。同時，金黃色葡萄球菌的mecA被大量

7、誘導，但Northem blot檢測不到松鼠葡萄球菌mecA的表達。K3 homo<'*>衍生菌的金黃色葡萄球菌mecA表達輕微提高，但也未能檢測到松鼠葡萄球菌mecA在RNA水平的表達。K3和K8分別為SCCmec ⅢB和SCCmec ⅢA型，SCCmec準確的插入到orfX區(qū)。K1和K3 orfX區(qū)的基因排布和表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌相似而和金黃色葡萄球菌差異較大。orfX和mecA基因在染色體上的位置隨菌株不同而不同。鑒定了6種

8、PBPs，其中PBP4 即為松鼠葡萄球菌mecA的表達產物，對苯唑西林呈低親和力。PBP6在苯唑西林耐藥性方面可能發(fā)揮了重要作用。苯唑西林耐藥菌細胞壁交聯(lián)率高于敏感菌，但交聯(lián)率的高低和菌株的MIC值并不呈線形關系。在抗生素壓力下，金黃色葡萄球菌的mecA產物能利用松鼠葡萄球菌細胞壁合成前體合成松鼠葡萄球菌的細胞壁。 結論：在兩個mecA共存的松鼠葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌mecA和抗藥性直接相關，但也不能排除松鼠葡萄球菌mecA