精子特異性LRRC52的生理學(xué)功能.pdf

1、闡明精子功能調(diào)控機(jī)制是診斷和治療男性不育、研發(fā)新型男性避孕藥的前提。離子通道是調(diào)控精子功能的關(guān)鍵因子。精子特異性SLO3通道是生理?xiàng)l件下調(diào)控精子功能的主要K+通道。離體實(shí)驗(yàn)表明，睪丸特異性表達(dá)的LRRC52(Leucine-Rich-Repeat-Containingprotein52)具有調(diào)節(jié)SLO3通道的功能。然而，LRRC52是否為SLO3的在體調(diào)節(jié)亞基尚不清楚。本研究設(shè)計(jì)、制備抗LRRC52胞外段的多克隆抗體，對小鼠和正常人精子

2、LRRC52生理功能及其機(jī)制進(jìn)行研究。應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫熒光、電生理及精子功能分析等手段，我們發(fā)現(xiàn)LRRC52是SLO3通道的在體調(diào)節(jié)亞基，是介導(dǎo)精子鉀電流(IKSper)的關(guān)鍵組分。此外，我們的結(jié)果還提示，LRRC52可作為設(shè)計(jì)精子功能調(diào)控化合物的分子靶點(diǎn)。
　　第一部分：LRRC52在小鼠成熟精子的表達(dá)、定位及與SLO3的關(guān)系
　　為獲得能從細(xì)胞外特異性作用于LRRC52的化合物，我們設(shè)計(jì)制備了抗LRRC52胞外段的多

3、克隆抗體(LID1)。通過Westernblot、精子凝集實(shí)驗(yàn)、免疫熒光和免疫共沉淀等技術(shù)，我們驗(yàn)證了所獲抗體的特異性，研究了在體條件下LRRC52與SLO3的相關(guān)性。結(jié)果表明:1）小鼠精子蛋白中可檢測到LRRC52，LID1孵育的精子發(fā)生明顯的凝集反應(yīng);2）LRRC52分布于小鼠精子尾部，尤以中段明顯，并與SLO3存在明顯的共定位;3）小鼠精子LRRC52與SLO3構(gòu)成蛋白復(fù)合體。這些結(jié)果提示，LRRC52是SLO3的潛在調(diào)節(jié)亞基。<

4、br>　　第二部分：LRRC52對小鼠成熟精子膜電流的影響
　　為闡明LRRC52的生理功能，我們應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究了LID1對精子膜電流的影響。結(jié)果表明:1）LID1顯著抑制小鼠IKSper但不影響精子鈣電流（ICatSper）;2）LID1對IKSper電導(dǎo)-電壓曲線（G-V曲線）的影響與異體表達(dá)系統(tǒng)中LRRC52亞基對SLO3的作用相符。這些結(jié)果提示LRRC52是構(gòu)成精子鉀通道、介導(dǎo)精子鉀電流的重要組分。
　　第

5、三部分：LRRC52對小鼠成熟精子生理功能的影響
　　應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)、金霉素(CTC)染色、體外受精(IVF)、調(diào)節(jié)性體積下降(RVD)檢測等實(shí)驗(yàn)手段，我們觀察了LID1對精子活力、頂體反應(yīng)(AR)、體外受精能力及RVD等相關(guān)生理功能指標(biāo)的影響。結(jié)果表明:1）LID1顯著抑制小鼠精子總運(yùn)動(dòng)力、直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)和平均路徑速度(VAP);2)LID1不影響自發(fā)性AR的發(fā)生率，但顯著抑制A231

6、87誘發(fā)的AR發(fā)生率;3）LID1孵育對精子RVD能力的影響不顯著;4）LID1顯著抑制小鼠精子的體外受精率。這些結(jié)果提示，LRRC52在精子生理功能中扮演重要角色，是開發(fā)調(diào)控精子功能化合物的潛在分子靶點(diǎn)。
　　第四部分：LRRC52在人成熟精子的表達(dá)及其生理功能
　　介導(dǎo)人精子IKSper的離子通道分子組成尚不清楚。由于用于制備LID1的LRRC52抗原片段在小鼠與人完全相同，我們用LID1初步觀察LRRC52在人精子的表