小鵝瘟病毒檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、小鵝瘟(Gosling Plague，GP)是由細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬中的鵝細(xì)小病毒(Goose Parvoviruse，GPV)引起的一種雛鵝急性或亞急性的敗血性傳染病。本病主要侵害30日齡以內(nèi)的雛鵝和雛番鴨，具有病程短，傳播快，發(fā)病率和致死率高的特點(diǎn)，死亡率高達(dá)90％-100％。但發(fā)病率和致死率隨著雛鵝日齡增大而下降。1周齡以內(nèi)的雛鵝或雛番鴨發(fā)病后迅速出現(xiàn)厭食、臟器衰竭，直至死亡，病程約為2-5d。近年來小鵝瘟在我國的一些省、市、自

2、治區(qū)均有流行，給養(yǎng)鵝業(yè)造成嚴(yán)重的危害，同時(shí)也給飼主帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此受到國內(nèi)外學(xué)者和工作者的廣泛關(guān)注。
　　 1.本試驗(yàn)建立了小鵝瘟病毒套式PCR診斷方法，針對(duì)VP3基因保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，通過優(yōu)化各種反應(yīng)條件，最后擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的長度為515bp的基因片段。特異性試驗(yàn)證明，僅有小鵝瘟病毒模板才能擴(kuò)增出特異性條帶。敏感性試驗(yàn)表明，當(dāng)模板中小鵝瘟病毒核酸含量為0.03264fg/μL時(shí)，仍能夠檢測到，并出現(xiàn)清晰的

3、特異性片段，比小鵝瘟病毒常規(guī)PCR診斷方法敏感性高出很多，假陽性率低。
　　 2.本試驗(yàn)根據(jù)Genbank發(fā)表的小鵝瘟病毒B株全基因序列，針對(duì)VP3基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)表達(dá)VP3主要結(jié)構(gòu)蛋白的特異性引物，PCR擴(kuò)增，得到了預(yù)期的1605bp的完整基因片段，與PMD19-T載體連接構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中克隆，經(jīng)過PCR鑒定和酶切分析鑒定正確后，將陽性重組克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體pColdⅠ雙酶切，連接構(gòu)

4、建重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性菌經(jīng)PCR鑒定和酶切分析鑒定正確后提取陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG37℃誘導(dǎo)表達(dá)，最后經(jīng)親和層析柱純化獲得VP3蛋白，經(jīng)Western blot分析所表達(dá)的蛋白可與小鵝瘟康復(fù)血清發(fā)生反應(yīng)。
　　 3.以純化的VP3蛋白作為抗原，通過優(yōu)化各步反應(yīng)條件，建立了檢測GPV抗體的間接ELISA方法。最終確定抗原最適包被濃度為0.625μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶40，陰陽性臨