普城沙雷氏菌G3菌株GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域蛋白PigX的功能研究.pdf

1、化學(xué)農(nóng)藥和化肥的過(guò)度使用已經(jīng)對(duì)環(huán)境和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。開(kāi)發(fā)利用環(huán)境友好的有益微生物進(jìn)行植物病害生物防治作為化學(xué)防治的替代或補(bǔ)充，有利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、維護(hù)生態(tài)平衡和保障食品安全性。但是生防微生物也存在抗菌譜狹窄、生防活性不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此篩選新的靶標(biāo)基因構(gòu)建具有高效和穩(wěn)定生防活性的工程菌株具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白在細(xì)菌中廣泛存在，大量研究已表明它們參與調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成、致病性、細(xì)胞分化和增

2、殖等多種生命活動(dòng)。然而，在植病生防菌中GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的相關(guān)研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）G3是分離自小麥內(nèi)莖的內(nèi)生菌，能夠產(chǎn)生多種抗真菌因子如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin, PRN)，以及植物促生物質(zhì)吲哚乙酸 IAA與乙偶姻，因而具有一定的生防和促生潛能。前期研究已表明 QS系統(tǒng)、Rsm系統(tǒng)、Hfq和 RpoS等全局調(diào)控因子參與調(diào)控 G3菌株

3、的生防活性。通過(guò)分析 S. plymuthica G3基因組序列鑒定了一個(gè)編碼GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的基因pigX，但是功能未知。
　　本研究以 S. plymuthica G3為模式菌鑒定pigX基因的生物學(xué)功能。首先通過(guò)構(gòu)建突變體和表型分析等策略，初步鑒定了PigX調(diào)控的生防相關(guān)表型；然后利用lux和lacZ報(bào)告基因分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄和翻譯融合，分析了PigX調(diào)控運(yùn)動(dòng)性和PRN合成等的分子機(jī)制，以及與QS系統(tǒng)、Rsm系統(tǒng)、H

4、fq和RpoS之間的相互作用及自我調(diào)控機(jī)制；最后利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)解析 pigX突變對(duì)穩(wěn)定期全細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的影響，以期更好地了解PigX在G3菌株中的生物學(xué)功能。PigX生物學(xué)功能的研究不僅可以進(jìn)一步了解 G3菌株生防活性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為更好地改良G3菌株的生防活性提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）利用基因替換、同源重組策略構(gòu)建了 pigX突變體 pigX::Gm；通過(guò)比較野生型 G3和 pigX::Gm突變體蛋白酶與

5、幾丁質(zhì)酶活性、運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成和抗真菌活性，發(fā)現(xiàn)PigX正調(diào)控蛋白酶、幾丁質(zhì)酶活性，以及運(yùn)動(dòng)性和抗真菌活性，負(fù)調(diào)控生物膜形成。通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌提取物中PRN及培養(yǎng)物中的IAA和乙偶姻，發(fā)現(xiàn) PigX正調(diào)控 PRN產(chǎn)生，負(fù)調(diào)控 IAA和乙偶姻的合成。以上研究結(jié)果表明PigX作為G3菌株多效調(diào)控子在調(diào)節(jié)內(nèi)生菌S. plymuthica與寄主植物有益互作中發(fā)揮重要作用。
　　（2）利用 lux和 lacZ報(bào)告基因分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄和翻譯融合，分

6、析了 PigX調(diào)控運(yùn)動(dòng)性、PRN合成的分子機(jī)制。結(jié)果表明 PigX正調(diào)控鞭毛主調(diào)控子操縱子flhDC和 PRN合成基因簇 prnABCD的轉(zhuǎn)錄和翻譯，這暗示了 PigX可能通過(guò)影響 flhDC的表達(dá)調(diào)控運(yùn)動(dòng)性，通過(guò)增強(qiáng) prnABCD的表達(dá)而正調(diào)控 PRN的合成。
　?。?）基于-lux和-lacZ的轉(zhuǎn)錄和翻譯融合分析表明 PigX與其它全局調(diào)控系統(tǒng)（子）之間存在密切的互作：A) PigX正調(diào)控 AHLs合成酶 splI和 sps

7、I的轉(zhuǎn)錄，所以可能通過(guò)影響AHLs的合成，進(jìn)而影響QS系統(tǒng)；B) PigX在穩(wěn)定期負(fù)調(diào)控rsmB的轉(zhuǎn)錄，正調(diào)控rsmA的轉(zhuǎn)錄，而RsmB和RsmC則正調(diào)控pigX的轉(zhuǎn)錄和翻譯；C) PigX自我正調(diào)控；D) PigX正調(diào)控 hfq的轉(zhuǎn)錄，同時(shí) Hfq正調(diào)控pigX的轉(zhuǎn)錄和翻譯；E) RpoS負(fù)調(diào)控pigX的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　?。?）運(yùn)用比較蛋白組學(xué)策略鑒定了 PigX在翻譯水平調(diào)控的靶蛋白，揭示了野生型 G3和 pigX::Gm突變

8、體在穩(wěn)定期（24h）蛋白表達(dá)譜的差異。MALDI-TOF/TOF MS共鑒定出了133個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，代表著128種蛋白。與野生型 G3相比，pigX::Gm突變體中79個(gè)點(diǎn)蛋白豐度上升，54個(gè)下降。GO和COG功能分析表明這些蛋白參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，氨基酸、碳水化合物、核酸、脂、無(wú)機(jī)物鹽的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白質(zhì)折疊，氧化脅迫，細(xì)胞包被和外膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在鑒定的差異蛋白點(diǎn)中，有15個(gè)參與碳水化合物的

9、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，17個(gè)與脅迫反應(yīng)相關(guān)，6個(gè)為外膜通道蛋白。進(jìn)一步 KEGG pathway分析顯示，多個(gè)蛋白參與糖酵解、糖異生和TCA循環(huán)等代謝途徑。其中重要差異蛋白點(diǎn)描述如下：
　　A) pigX突變影響外膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致外膜通道蛋白 OmpA、OmpC和 TolC表達(dá)量下降，這可能影響細(xì)菌分泌物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　B)饑餓/穩(wěn)定期保護(hù)蛋白Dps、超氧岐化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT和通用應(yīng)激蛋白 UspE在 pigX::Gm突變體中的

10、表達(dá)水平較野生菌都明顯下降。表型分析證實(shí)了 PigX正調(diào)控 SOD和 CAT活性，因而可能增加細(xì)菌對(duì)氧脅迫的耐受性，暗示PigX可能影響細(xì)菌的生態(tài)適應(yīng)性。
　　C)鞭毛蛋白在野生型 G3中特異表達(dá)，而 flhDC轉(zhuǎn)錄抑制子 LrhA在pigX::Gm突變體中高表達(dá)。SDS-PAGE和質(zhì)譜鑒定證實(shí)了 PigX正調(diào)控鞭毛蛋白產(chǎn)生，基于-lacZ的翻譯融合分析也驗(yàn)證了 PigX負(fù)調(diào)控 LrhA，正調(diào)控FlhDC。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PigX

11、可能至少部分通過(guò)影響鞭毛主調(diào)控子FlhDC及其轉(zhuǎn)錄抑制子 LrhA的表達(dá)激活鞭毛蛋白產(chǎn)生，從而正調(diào)控細(xì)菌鞭毛依賴(lài)的運(yùn)動(dòng)性。
　　綜上所述，PigX通過(guò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)QS和轉(zhuǎn)錄后Rsm系統(tǒng)、以及Hfq和RpoS等全局調(diào)控子互作整合進(jìn)入復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在 G3菌株中在多個(gè)水平全局調(diào)控細(xì)菌的各種生理活動(dòng)和行為，包括細(xì)菌分泌抗生素 PRN、植物生長(zhǎng)素IAA和乙偶姻，進(jìn)而影響細(xì)菌的生防活性和植物生長(zhǎng)促進(jìn)潛能，以及氧化應(yīng)激、運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成