十取代蘆丁硫酸鈉的質(zhì)量控制和藥物代謝動力學(xué)研究.pdf

1、十取代蘆丁硫酸鈉是一種抗艾滋病候選藥物,通過蘆丁半合成而獲得。另外,十取代蘆丁硫酸鈉還具有降低恒溫動物過敏反應(yīng)、治療風(fēng)濕病等由免疫系統(tǒng)引起的疾病的功能。
　　為了配合該候選藥物的研究開發(fā),本文按照一類新藥的申報要求,完成了該候選藥物的質(zhì)量分析、藥物代謝及其動力學(xué)研究。主要內(nèi)容包括了以下四個方面:
　　一、十取代蘆丁硫酸鈉的結(jié)構(gòu)鑒定和質(zhì)量研究實(shí)驗(yàn)運(yùn)用元素分析、IR、UV、1H-NMR、1H-1H COSY、13C-NMR、1H

2、-13C COSY、DEPT和MS證實(shí)十取代蘆丁硫酸鈉的結(jié)構(gòu)為:2-[3,4-二(磺氧基)苯基]-3-[[6-O-(6-去氧-2,3,4-三-硫酸基-α-L-吡喃糖基)-2,3,4-三-O—硫酸基-β-D-吡喃葡萄糖基]氧]-5,7-二(磺氧基)-4H-1-苯并吡喃-4-十鈉鹽,與預(yù)期合成的目標(biāo)化合物一致。用各種理化檢驗(yàn)方法對十取代蘆丁硫酸鈉的性狀、溶解度、氯化物、鐵鹽、砷鹽、重金屬、吸光系數(shù)、干燥失重、水分和有機(jī)殘留等進(jìn)行了測定。十取

3、代蘆丁硫酸鈉為淺黃色或類白色粉末,在水中溶解,在乙醚或氯仿中不溶。氯化物含量＜0.02％、鐵鹽＜0.002%、砷鹽＜2ppm、重金屬＜30ppm。在水溶液254nm處的吸光系數(shù)(ε)為15512.4,319nm為13090.4。干燥失重12.4%,費(fèi)休氏法測定水分含量為11.15%。實(shí)驗(yàn)采用在樣品溶液中加入氫氧化鈉使三乙胺游離的方法同時測定了可能殘留的有機(jī)溶劑三乙胺、正丁醇、二基乙酰胺、乙醇、乙醚和丙酮的含量。
　　實(shí)驗(yàn)在選擇和比

4、較了檢測波長(254 nm和326 nm)、色譜柱(C18、C8、C3、C1、PH、SB-Aq、NH2和CN柱)、離子對試劑類型(TEA、TMAB、TEAC和TBAB)、離子對試劑濃度（TBAB:5、10、15、20、25和30 mmol/L）、流動相pH值（4.4、5.2、6.0、6.8、7.5和8.0）、流動相離子強(qiáng)度(KH2PO4：5、10、15和20 mmol/L)等基礎(chǔ)上，確定分離測定十取代蘆丁硫酸鈉的色譜條件為：島津LC-2

5、010 C液相色譜儀，XDB-C8色譜柱，流動相：乙腈：25 mmol/LTBAB緩沖液（KH2PO4 10 mmol/L，三乙胺調(diào)節(jié)pH7.5）=48:52，流速：1.0 mL/min，檢測波長：λ=254 nm;柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20μL。在0.5～200.0μg/mL濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為A=12158.5 C+43.63，相關(guān)系數(shù)R=0.9999。不同濃度的準(zhǔn)確度94.7%～98.0%，日內(nèi)精密

6、度和日間精密度均小于3.5%。溶液中十取代蘆丁硫酸鈉的LOD=0.2μg/mL，LOQ=0.5±0.036 μg/mL。經(jīng)實(shí)驗(yàn)認(rèn)證表明本法專屬性良好，符合十取代蘆丁硫酸鈉的含量測定和有關(guān)物質(zhì)檢查的要求，實(shí)驗(yàn)同時考察了十取代蘆丁硫酸鈉水溶液在不同溫度和不同pH條件下的穩(wěn)定性。
　　本品經(jīng)高溫試驗(yàn)（40℃和60℃）、高濕度試驗(yàn)（RH75±5%和RH 90±5%）和強(qiáng)光照射試驗(yàn)（4500±500lx）下放置10天。高溫(40℃，60℃)

7、下10天，其外觀與放置前比較沒有明顯變化，但含量和有關(guān)物質(zhì)卻發(fā)生了改變，特別在高溫60℃條件下，十取代蘆丁硫酸鈉含量明顯下降，有關(guān)物質(zhì)含量明顯升高。本品在高濕環(huán)境下，性狀發(fā)生明顯改變，供試品從固體變成半流質(zhì)狀的物質(zhì)；顏色發(fā)生變化，從淺黃色變成深綠色；含量明顯下降，高濕度試驗(yàn)的5天和10天樣品中均檢測不到十取代蘆丁硫酸鈉的存在；吸濕性明顯，10天樣品的引濕率近50%。強(qiáng)光照射（4500士500 lx）試驗(yàn)顯示，其外觀、含量和有關(guān)物質(zhì)與0天

8、樣品比較沒有明顯變化，表明供試品原料藥在強(qiáng)光照射條件下相對穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)提示高溫和濕度明顯影響本品的質(zhì)量，尤以濕度的影響為甚，而強(qiáng)光照對供試品基本沒有明顯影響。因此，為保證供試品的質(zhì)量，樣品應(yīng)低溫、密閉干燥保存。
　　二、十取代蘆丁硫酸鈉的體內(nèi)代謝動力學(xué)研究
　　建立了測定大鼠血漿中十取代蘆丁硫酸鈉含量的離子對一反相高效液相色譜方法（IP-RP-HPLC）。大鼠血漿樣品中加入等量的0.2 mol-L-1的TBAB溶液（含內(nèi)標(biāo)）并

9、堿化，然后用SPE的方法進(jìn)行處理，收集甲醇洗脫液后揮干濃縮，用流動相復(fù)溶后進(jìn)樣，采用峰面積內(nèi)標(biāo)法測定十取代蘆丁硫酸鈉的血藥濃度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)認(rèn)證表明本法專屬性良好，十取代蘆丁硫酸鈉的血漿濃度在1.0～200.0Lig.mL-1的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y=0.3944 C-0.1093，相關(guān)系數(shù)R=0.9997，LOQ=1.0±0.1μg.mL-1。低、中、高（2.0、10.0、50.0 μg.mL-1）3種濃度的準(zhǔn)確度分別

10、為：98.6%、98.1%和101.3%，提取回收率60.00～62.53%，日內(nèi)精密度2.7～4.9%，日間精密度3.4～8.9%。血漿樣品穩(wěn)定性考察顯示十取代蘆丁硫酸鈉在反復(fù)凍融3次、室溫下放置24 h和-24℃條件下放置4周均相對穩(wěn)定。證明本實(shí)驗(yàn)方法適用于大鼠血漿中十取代蘆丁硫酸鈉的含量測定。
　　大鼠尾靜脈注射給藥三個劑量：5、20、100 mg.kg-1．血藥濃度一時間曲線數(shù)據(jù)用3p97軟件進(jìn)行模型擬合和藥代動力學(xué)參數(shù)的

11、計(jì)算。根據(jù)最小AIC準(zhǔn)則，血藥濃度一時間曲線符合靜脈注射二室模型，其中權(quán)重為1/C。三種劑量下平均消除半衰期tl 2p為205.9±11.1 min，消除速率常數(shù)K6為0.0034±0.0002 min-l，AUC分別為3391.0、14838.8和88598.2 μg.min.mL-1，并且給藥劑量與AUC具有良好的線性關(guān)系，藥動學(xué)參數(shù)與給藥劑量無關(guān)，提示十取代蘆丁硫酸鈉在大鼠體內(nèi)的處置情況屬于線性動力學(xué)。
　　建立了測定大鼠尾

12、靜脈注射給藥后尿液和膽汁中十取代蘆丁硫酸鈉的HPLC方法，并考察了十取代蘆丁硫酸鈉經(jīng)尿液和膽汁的排泄情況，確定了主要的排泄途徑。方法學(xué)考察顯示本方法測定尿液和膽汁中的十取代蘆丁硫酸鈉專屬性均良好，在不同的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系均良好，分別為尿液R=0.1362C-0.1187(R=0.9981)，膽汁R=0.1232 C-0.0753(R=0.9995)。十取代蘆丁硫酸鈉在不同體系中的提取回收率為57.44～61.07%，準(zhǔn)確度98.0～

13、102.1%。12只大鼠分為2組，尾靜脈注射20 mg.kg-1的十取代蘆丁硫酸鈉后分別進(jìn)行尿液收集和膽汁收集，在36h內(nèi)，尿液和膽汁的累積排泄量率為86.4%，其中尿液為86.0±6.1%，膽汁為0.3181±0.2087%。給藥36h后，十取代蘆丁硫酸鈉原型藥物在體內(nèi)基本消除完全。說明靜脈注射十取代蘆丁硫酸鈉以后，藥物主要從腎臟進(jìn)行排泄。
　　三、十取代蘆丁硫酸鈉的體外代謝研究
　　運(yùn)用鼠肝微粒體體外孵育的方法進(jìn)行十取代

14、蘆丁硫酸鈉的體外代謝研究，結(jié)果表明十取代蘆丁硫酸鈉在空白鼠肝微粒體及經(jīng)不同誘導(dǎo)劑(BNF，Dex和PB)誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中的代謝不明顯。十取代蘆丁硫酸鈉對大鼠CYP450的抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)十取代蘆丁硫酸鈉對CYP450的不同亞型：CYP3A4、CYPIA2、CYP2B、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6均沒有顯著的抑制作用。
　　運(yùn)用超濾法測定了三種濃度（5、20和100 μg.mL-1）十取代蘆丁硫酸鈉與SD大鼠、Beagl

15、e犬、人的血漿蛋白、人血清白蛋白(HSA)和人酸性糖蛋白(Humanal-AGP)的蛋白結(jié)合率。建立測定不同體系中十取代蘆丁硫酸鈉的方法學(xué)，并校正超濾膜對測定結(jié)果的影響。配對t檢驗(yàn)的結(jié)果表明十取代蘆丁硫酸鈉的蛋白結(jié)合率在SD大鼠、Beagle犬和人血漿蛋白結(jié)合中表現(xiàn)非種屬依賴性和非濃度依賴性(P>0.05)。十取代蘆丁硫酸鈉與SD大鼠、Beagle犬和人血漿蛋白結(jié)合率為80～90%。十取代蘆丁硫酸鈉與不同類型蛋白(HSA和Human a

16、l-AGP)的結(jié)合率差異很大。其中，與HSA為85.7±1.3%．而與Human al-AGP則為14.0±3.2%。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明有極顯著性差異(P<0.001)。
　　四、十取代蘆丁硫酸鈉在大鼠與人腸道菌群中的代謝和代謝物的結(jié)構(gòu)確證
　　根據(jù)十取代蘆丁硫酸鈉的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和腸道菌群代謝的特點(diǎn)，測定了十取代蘆丁硫酸鈉在不同來源腸道菌群培養(yǎng)液中的代謝情況。首先收集大鼠和人的糞便制備成腸道菌群培養(yǎng)液并預(yù)孵育，將十取代蘆丁硫酸

17、鈉加入培養(yǎng)液中于37℃條件下進(jìn)行氧厭培養(yǎng)，樣品經(jīng)過前處理，用IP-RP-HPLC方法測定腸道菌群培養(yǎng)液中剩余十取代蘆丁硫酸鈉的含量，根據(jù)加入量計(jì)算代謝率，并比較十取代蘆丁硫酸鈉在兩種不同來源的腸道菌群中的代謝情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在共同培養(yǎng)24 h后，十取代蘆丁硫酸鈉產(chǎn)生代謝，且在不同來源的腸道菌群培養(yǎng)液中的代謝率差異很大，其中在大鼠腸道菌群培養(yǎng)液中代謝率為73.5±6.7%，在人的腸道菌群培養(yǎng)液中代謝率為24.5±3.5%，配對t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者

18、之間存在顯著差異。同時，實(shí)驗(yàn)觀察到3個可能的代謝產(chǎn)物。
　　為確證十取代蘆丁硫酸鈉在大鼠腸道菌群培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)將高濃度的十取代蘆丁硫酸鈉在大鼠腸道菌群培養(yǎng)液中于37℃條件下厭氧培養(yǎng)15天，得到相對高濃度的3個代謝物(M2、M3和M4)，利用IP-SPE、IP-RP-HPLC、冷凍干燥、葡聚糖凝膠純化、活性炭除臭脫色、微膜過濾等步驟得到純度較高（峰面積歸一化法大于98%）的代謝物M3，然后根據(jù)M3的HPLC出峰時間快于

19、十取代蘆丁硫酸鈉、UV和DAD圖譜與十取代蘆丁硫酸鈉類似、IH-NMR和13C-NMR顯示沒有質(zhì)子數(shù)和碳原子數(shù)的變化、IH-NMR上只有6-H、8-H與十取代蘆丁硫酸鈉有差別、13C-NMR上只有6-C、8-C與十取代蘆丁硫酸鈉有差別等實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，確證M3的結(jié)構(gòu)為：5,7-0-二脫磺酸十取代蘆丁硫酸鈉。最后利用十取代蘆丁硫酸鈉的硫酸酯酶代謝產(chǎn)物(M1～M4)與腸道菌群代謝產(chǎn)物M3的關(guān)系進(jìn)一步驗(yàn)證了M3的結(jié)構(gòu)，并初步確定M1、M2和M4的結(jié)