TNF-α和PGE-,2-對人牙周膜成纖維細胞RANKL-OPG mRNA表達的影響.pdf

1、人牙周膜成纖維細胞(Human periodontal ligament fibroblasts，HPDLFs)是牙周膜細胞最主要的細胞成份，不僅能合成牙周膜細胞外基質(zhì)中大多數(shù)的各型膠元纖維和蛋白多糖，而且還通過分泌和合成多種多樣的細胞因子與酶共同參與調(diào)節(jié)牙周組織的代謝和改建。最新研究發(fā)現(xiàn)，HPDLFs對核因子-kB受體活化因子配體(receptor activatorofNF-kB ligand，RANKL)及其餌受體骨保護素(ost

2、eoprotegerin，OPG)調(diào)控是這一調(diào)控機制的主要通路。因此，HPDLFs在牙槽骨骨代謝和牙周健康及疾病中扮演了重要角色。HPDLFs能夠合成分泌RANKL，從而促進破骨細胞成熟，導(dǎo)致骨吸收；同時HPDLFs產(chǎn)生OPG，一種可溶性腫瘤壞死因子超家族成員，能夠正向調(diào)控骨質(zhì)密度。相關(guān)研究認為牙周組織中的RANKL和OPG是各種刺激因子誘導(dǎo)破骨細胞(osteoclast，OC)生成及功能信號傳導(dǎo)的最終因子，與牙槽骨的吸收存在著明顯的相

3、關(guān)性。最新觀點認為，HPDLFs所調(diào)控的RANKL和OPG之間的平衡機制，是牙周炎病程中牙槽骨吸收破壞的重要原因。文獻報道大量炎癥因子參與了牙周炎的發(fā)病機制，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)能夠產(chǎn)生牙周局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙周組織和牙槽骨的吸收破壞。雖然有實驗證明由HPDLFs所分泌的炎癥因子可以導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生，但是HPD

4、LFs中TNF-α和PGE2產(chǎn)生這一生理學(xué)作用的細胞學(xué)和分子學(xué)機理尚未完全闡明。 本實驗建立HPDLFs體外培養(yǎng)體系，采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和熒光定量PCR(fluorescentquantitative RT-PCR，F(xiàn)Q-RT-PCR)的方法，檢測了體外培養(yǎng)的HPDLFs在TNF-α和PGE2的作用下其RANKL、

5、OPG mRNA的表達變化，為探討細胞因子通過介導(dǎo)HPDLFs中RANKL、OPG mRNA的表達，參與牙槽骨內(nèi)環(huán)境平衡調(diào)節(jié)提供參考依據(jù)。 目的： 研究TNF-α和PGE2單獨與聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的HPDLFs，檢測對其RNAKL和OPG mRNA表達的影響。 方法： 1.HPDLFs培養(yǎng)及鑒定：HPDLFs來源于臨床上因正畸或阻生而拔除的健康牙，采用組織塊法分離獲得，進行原代培養(yǎng)，觀察HPDLFs的生長

6、狀態(tài)及細胞形態(tài)，免疫細胞化學(xué)SP法進行鑒定。 2.TNF-α對HPDLFs的RANKL和OPG mRNA表達的影響：取第5代HPDLFs用濃度為1～100 ng/ml TNF-α處理24 h，通過RT-PCR檢測RANKL、OPG mRNA表達情況。 3.PGE2對HPDLFs的RANKL和OPG mRNA表達的影響：將10-9～10-6mol/L PGE2。分別加入HPDLFs培養(yǎng)液中，共同培養(yǎng)2h、8h、24h和48

7、h，通過RT-PCR檢測RANKL、OPG mRNA表達強度變化。 4.TNF-α和PGE2聯(lián)合作用對HPDLFs的RANKL和OPG mRNA表達的影響：將體外培養(yǎng)的HPDLFs用1～100 ng/ml TNF-α和10-8～10-6 mol/L PGE2不同濃度組合處理24h，通過FQ-RT-PCR檢測RANKL、OPG mRNA表達水平。 結(jié)果： 1.HPDLFs增殖快，呈放射狀生長，細胞呈長梭形，采用免疫

8、組化染色，波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。 2.TNF-α作用于HPDLFs后增強RANKL mRNA表達，RANKL/OPG比值呈上升趨勢，其中以10 ng/ml TNF-α作用最為明顯。 3.10-9～10-6 mol/L PGE2作用于HPDLFs后，在2～24h內(nèi)增強RANKL mRNA表達，抑制OPG mRNA表達，RANKL/OPG比值升高，以10-7mol/L PGE2作用最為明顯。 4. TN

9、F-α和PGE2聯(lián)合作用于HPDLFs，可增強RANKL mRNA表達及RANKL/OPG比值，以lOng/ml TNF-α+10-7mol/L PGE2組合時作用最為明顯。 結(jié)論： 1.TNF-α和PGE2單獨和聯(lián)合作用均可刺激HPDLFs的RANKL/OPG mRNA表達比值，說明二者能夠有效調(diào)節(jié)HPDLFs中RANKL/OPG的表達。因此，TNF-α和PGE2可能通過作用HPDLFs，調(diào)節(jié)RANKL/OPG的比例，