IL-17誘導(dǎo)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL、OPG的p38MAPK通路研究.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　通過觀察p38MAPK信號通路抑制劑(SB203580)對人牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLF)表達(dá)RANKL、OPG的影響，探究p38MAPK信號通路是否參與IL-17、HPDLF介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的過程。明確IL-17誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞促骨吸收作用的可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，探討IL-17參與正畸相關(guān)炎性牙根吸收的發(fā)生機(jī)制。
　　實驗方法:
　　1.采用組織塊培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)原代HPDLF，并進(jìn)行傳代純化。取第4代細(xì)

2、胞，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法，對所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行來源鑒定。MTT法分別檢測0、2.5、5、10、20、40μ mol/L的p38MAPK抑制劑對HPDLF增殖活性的影響。
　　2.Western blot檢測20ng/ml的IL-17刺激HPDLF(0、20、40、60、80min)后，細(xì)胞內(nèi)p38MAPK磷酸化蛋白的表達(dá)情況。
　　3.實驗分為六組:A組（空白對照）、B組(DMSO)、C組（抑制劑）、D組（IL-17）、E組

3、（IL-17+DMSO）、F組（IL-17+抑制劑）。按照分組，用10μmol/L的SB203580，20ng/ml的IL-17處理細(xì)胞。RT-PCR檢測 HPDLF中RANKL、OPG因子的mRNA表達(dá)水平;Western blot、ELISA檢測HPDLF中RANKL、OPG因子的蛋白表達(dá)水平。
　　實驗結(jié)果:
　　1.培養(yǎng)的細(xì)胞為長梭形，呈放射狀生長;傳代后細(xì)胞均勻分布，生長狀態(tài)穩(wěn)定。經(jīng)鑒定該細(xì)胞為來源于間充質(zhì)細(xì)胞，且

4、非上皮來源的細(xì)胞。結(jié)合取材部位可判定細(xì)胞為HPDLF。MTT結(jié)果顯示，以濃度為0-40μ mol/L的SB203580分別刺激HPDLF，0-10μ mol/L中，OD值隨著濃度的增加持續(xù)升高，HPDLF增殖活性逐漸增強(qiáng)。在10μ mol/L中，OD值最大，HPDLF增殖活性達(dá)到最強(qiáng)。10-40μ mol/L中，OD值隨著濃度的增加逐漸下降，HPDLF增殖活性逐漸降低。
　　2.在20ng/ml的IL-17刺激下，磷酸化p38MA

5、PK(p-p38MAPK)的相對表達(dá)量隨著時間的增加而增大。在60min時達(dá)最高水平，80min時開始下降。
　　3.與空白對照組比較，IL-17刺激后RANKL的mRNA、蛋白表達(dá)量升高;OPG的mRNA表達(dá)量降低;RANKL/OPG的mRNA比值升高。加入抑制劑后，IL-17刺激RANKL的mRNA、蛋白表達(dá)量降低;OPG的mRNA表達(dá)量升高，RANKL/OPG的mRNA比值降低。IL-17調(diào)控RANKL、OPGmRNA表達(dá)的

6、作用，被p38MAPK抑制劑阻斷。
　　實驗結(jié)論:
　　1.組織塊培養(yǎng)法成功地建立了人牙周膜成纖維細(xì)胞系。經(jīng)傳代，細(xì)胞純化，細(xì)胞生物學(xué)性狀穩(wěn)定。適宜濃度的SB203580對HPDLF增殖活性有促進(jìn)作用，但過大濃度的SB203580抑制HPDLF增殖，其中10μ mol/L為HPDLF的最適濃度。
　　2.IL-17能激活p38MAPK蛋白，且存在時間依賴性。IL-17通過p38MAPK通路促進(jìn)HPDLF中RANKL的表