骨骼肌缺血再灌注致心肌損傷蛋白質組學研究.pdf

1、研究目的
　　差異蛋白質組學為我們提供了全面、系統(tǒng)了解創(chuàng)傷應激心肌損傷表達差異的工具。為深入探討骨骼肌缺血再灌注創(chuàng)傷致心肌損傷的生物學機制，本研究采用蛋白質組學技術，較全面、高通量地篩選鑒定骨骼肌缺血再灌注心肌損傷的相關蛋白質，旨在發(fā)現缺血再灌注心肌損傷中尚未研究報道的蛋白及其在心肌損傷過程中的作用。
　　研究方法
　　1、建立大鼠骨骼肌缺血再灌注心肌損傷模型：雄性Wistar大鼠20只，分為2組：假手術組（sham)

2、10只，缺血再灌注(IR)組（缺血4小時、再灌注4小時)10只。實驗結束后，下腔靜脈取血，觀察指標：血清CK,CYCS；肌鈣蛋白T；心肌HE染色；心臟超聲對模型動物的心臟功能進行評價。
　　2、大鼠心肌蛋白雙向凝膠電泳及結果分析：再灌注結束后，取左心室部分放入液氮冷凍。心肌組織全蛋白提取后行雙向凝膠電泳(2-DE)，經凝膠染色、掃描后獲得2-DE圖譜，運用ImageMaster2DPlatinum5.0凝膠圖像分析軟件對2-DE凝

3、膠圖像進行差異表達分析,差異明顯蛋白點經膠內酶切后以納升超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜NanoUPLC-ESI-MS/MS進行分析，通過Mascot數據庫檢索鑒定差異蛋白質。
　　3、在大鼠骨骼肌缺血再灌注心肌損傷模型上，采用Westernblot及免疫組化驗證候選差異蛋白的表達。
　　研究結果
　　1、大鼠骨骼肌缺血4小時再灌注4小時后造成心肌損傷（肌鈣蛋白升高，HE染色大體結構改變），心臟收縮功能下降。
　　

4、2、以假手術組及模型組心肌蛋白行雙向電泳，得到聚焦良好、顯色清晰、相似性高的2-DE圖譜，以Imagemaster軟件對各組圖譜分析后得到15個差異表達蛋白點，差異點分布在pI5.0-8.0、分子量14.0kDa-66.0kDa之間。其中9個蛋白點上調，6個蛋白點表達下調，將各點行膠內酶解、質譜分析后獲得差異表達蛋白譜。
　　3、通過分析差異表達蛋白譜，發(fā)現其功能涉及到細胞骨架相關蛋白：myozenin，心臟型肌球蛋白結合蛋白；能

5、量代謝相關蛋白：NADH脫氫酶（泛醌）1α亞復合體亞單位10，磷酸丙糖異構酶，腺苷酸激酶同工酶1，蘋果酸脫氫酶，琥珀酰輔酶A轉移酶，細胞色素C氧化酶亞單位VIa；應激相關蛋白：αB-晶狀體蛋白，輔酶Q7，熱休克蛋白B7；其他蛋白：細胞因子誘導凋亡抑制因-1（CIAPIN1），功能定位未知的推測蛋白。
　　4、我們用Westernblot及免疫組化方法回復驗證了不同類別的三種蛋白（CIAPIN1、myozenin和TIM）在兩組動物

6、心肌組織中的表達變化，證實了2-DE結果的可靠性，為下一步功能驗證提供可靠的實驗依據。
　　結論
　　1、成功復制骨骼肌缺血再灌注心肌損傷動物模型。該模型操作簡便可靠，重復性好，可以模擬與臨床相近的損傷，為下一步研究提供了可靠的實驗模型。
　　2、成功獲得分辨率高、重復性好的假手術組及骨骼肌缺血再灌注心肌蛋白電泳圖譜。比較分析差異組間發(fā)現15個差異點，鑒定得到的差異蛋白質涵蓋了細胞骨架相關、能量代謝相關、應激反應相關及