產(chǎn)前雄激素化的SD雌鼠多囊卵巢綜合征樣特征.pdf

1、前言:
　　多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,簡稱PCOS),是一種常見的婦科內(nèi)分泌疾病,以持續(xù)不排卵和高雄激素為主要特征,其發(fā)生率占育齡婦女的5~10％,占不排卵婦女的75~80%。PCOS的統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)始見于1935年,Stein和Leventhal描述為閉經(jīng)、多毛和雙側(cè)卵巢多囊性增大的無排卵相關(guān)綜合征。1990年美國國家健康委員會(National Institute of Health,

2、NIH)會議規(guī)定其診斷標(biāo)準(zhǔn)為“臨床或生化有高雄激素表現(xiàn),持續(xù)無排卵和除外其他疾病”。但經(jīng)多年臨床觀察發(fā)現(xiàn),大部分 PCOS患者超聲有卵巢多囊性改變。因此,關(guān)于這個診斷標(biāo)準(zhǔn)一直存在爭議。2003年在荷蘭鹿特丹(Rotterdam)定義了PCOS新的診斷標(biāo)準(zhǔn),把卵巢的形態(tài)學(xué)改變“多囊性卵巢”作為其診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn):
　　(1)排卵少或不排卵;
　　(2)有高雄激素血癥的臨床和生化特征;
　　(3)超聲檢查有多囊

3、性卵巢。排除其它雄激素過高相關(guān)疾病。
　　2006年雄激素過高協(xié)會(Androgen Excess Society,AES)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為:
　　(1)多毛及/或高雄激素血癥;
　　(2)稀發(fā)排卵或無排卵及/或多囊卵巢;
　　(3)排除其它雄激素過高相關(guān)疾病,如先天性腎上腺增生癥(Congenital adrenal hyperplasia,CAH)、柯興氏征、高泌乳素血癥、嚴(yán)重的胰島素抵抗綜合征、分泌雄激素的腫瘤、甲

4、狀腺功能異常等。
　　此外還有與PCOS相關(guān)的體征和癥狀:
　　生殖內(nèi)分泌方面,有:
　　(1)LH分泌過高;
　　(2)腎上腺雄激素分泌過高;
　　(3)卵巢對促性腺激素刺激反應(yīng)性過高;
　　(4)高流產(chǎn)率;
　　(5)子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌;
　　(6)妊娠期糖尿病,等。
　　代謝方面,有:
　　(1)胰島素抵抗及高胰島素血癥;
　　(2)葡萄糖耐量降低;
　

5、　(3)II型糖尿病;
　　(4)肥胖;
　　(5)胰腺對葡萄糖反應(yīng)受損;
　　(6)高脂血癥,等。
　　此外心血管疾病、睡眠呼吸暫停綜合征、痤瘡、慢性炎癥的發(fā)病率增加。
　　但目前其發(fā)病原因仍不清楚,現(xiàn)多數(shù)學(xué)者認(rèn)為:可能是一種遺傳因素和環(huán)境因素共同決定的多因素異質(zhì)性疾病,治療方面只能治標(biāo)不能治本,需要藥物維持才能緩解癥狀。因此,進(jìn)一步探討其病因及發(fā)病機(jī)制對PCOS的治療有極大的推動作用。然而,對人體進(jìn)行P

6、COS研究存在局限性,尤其是在發(fā)病機(jī)制方面,因此對相應(yīng)模型動物的研究也成為一種必需,所建立的模型如外源性雄激素所造模型、雌激素所造模型、持續(xù)光照所造模型,盡管均能夠從不同側(cè)面反映 PCOS,但是不能夠全面反映 PCOS內(nèi)分泌改變及局部性腺病理改變,也不能夠充分說明其發(fā)病原因。
　　為了解決上述矛盾,科學(xué)家作了大量研究,研究者發(fā)現(xiàn):胎兒時期,身體各組織和器官都會經(jīng)歷發(fā)育的敏感階段,此敏感階段可能與細(xì)胞的快速分裂相關(guān)。如果在這個敏感階

7、段受到某種刺激或損傷,將會導(dǎo)致終生的影響。最近對動物研究表明,PCOS可能與此有關(guān)?？赡苁怯捎谠谌焉锾浩?循環(huán)雄激素過高刺激下,對胎兒生殖腺等產(chǎn)生影響,導(dǎo)致成年后PCOS的發(fā)生。Abbott等對猴的研究已證實,妊娠期暴露過高雄激素的雌性恒河猴,成年后的體征和癥狀與PCOS患者相似,第一次對PCOS發(fā)生起源進(jìn)行了觀察,證實了PCOS的“成人疾病胎源說”觀點。
　　由于上述原因,本課題選擇 Sprague—Dawley(SD)大鼠(

8、正常妊娠周期為21~22天)進(jìn)行實驗,對此大鼠于妊娠期16~19天每日皮下注射睪酮(Testosterone,T)或者雙氫睪酮(Dihydrotestostrone,DHT)4mg,注藥劑量選擇參考了以前有關(guān)研究者關(guān)于 SD大鼠下丘腦研究的相關(guān)文獻(xiàn)資料。此注射時間和劑量選擇依據(jù):在妊娠過程中給予此雄激素劑量能夠部分雄性化肛門-生殖器距離和性行為。本研究以期其癥狀與體征與PCOS患者更加相似,并在此基礎(chǔ)上,對PCOS的發(fā)病機(jī)制及原因進(jìn)行更

9、深入的分析探究。
　　目的:
　　PCOS發(fā)病原因未明,進(jìn)一步探討其病因及發(fā)病機(jī)制對PCOS的診斷治療有極大的推動作用。然而,對人進(jìn)行發(fā)病機(jī)制方面的研究尚有局限性,如不能切除卵巢,不能獲得下丘腦等性腺軸標(biāo)本等等。而且,目前許多動物模型也僅僅從不同側(cè)面反映PCOS的相關(guān)體征和癥狀,未進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平探討其發(fā)病原因。由于上述原因,本課題使用 SD大鼠妊娠期給予雄激素即模擬妊娠期過高雄激素狀態(tài),觀察雄激素對動物的影響,并在此

10、基礎(chǔ)上,對PCOS的原因進(jìn)行深入的分析探究。具體為:
　　1. SD大鼠在妊娠期16~19天每日皮下注射T或者DHT4mg構(gòu)造出妊娠期雄激素過高大鼠。對妊娠期雄激素過高和對照組 SD大鼠卵巢切除后進(jìn)行苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate,EB)刺激,分析孕酮受體(Progesterone Receptor,PgR)mRNA的表達(dá)水平,從分子生物學(xué)方面了解妊娠期雄激素過高大鼠下丘腦的變化情況。
　　2.觀察各組出

11、生后雌性小鼠外生殖器的變化,了解妊娠期雄激素過高對雌鼠外生殖器的影響。
　　3.觀察妊娠期雄激素過高雌性大鼠動情周期及激素分泌方式的改變情況,與 PCOS患者內(nèi)分泌及月經(jīng)周期變化的相似性進(jìn)行比較。
　　4.對妊娠期雄激素過高及正常雌性大鼠的代謝特征進(jìn)行研究,了解各組大鼠代謝特征的變化。
　　方法:
　　1.大鼠以4:1或3:1雌雄比例合籠,出現(xiàn)陰道栓為妊娠第1天。后在妊娠16~19天實驗組皮下注射上述睪酮或雙氫睪

12、酮4mg+0.2ml注射用油,空白組注射0.2ml注射用油,出生后81日(SD大鼠60日后處于成年期,生理結(jié)構(gòu)發(fā)育完善)上午11:00~11:30對照組在動情間期手術(shù)切除卵巢,實驗組在相同時間進(jìn)行同樣處理,然后迅速注射苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate,EB)30μg,第二天中午12點迅速斷頭處死大鼠,取出的下丘腦視前區(qū)(Preoptic area,POA),迅速放入液氮中保存。然后進(jìn)行RT-PCR實驗,分析其PgR m

13、RNA表達(dá)情況,從分子生物學(xué)方面了解妊娠期雄激素對成年后下丘腦的影響。
　　2.給藥方式同上,小鼠在出生后第2日、第22日、第60日(Postnatal day2,PND2;同樣,PND22,PND60),測量肛門生殖器距離(Anogenital distance,AGD);第13日檢查乳頭情況。
　　3.給藥方式同上。(1)60~70日時,上午11:00~11:30對照組仔鼠在動情間期,實驗組在相同日期(無陰道,不能進(jìn)行陰

14、道涂片),戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg,ip),無菌注射器下腔靜脈采血,制備的血清觀察激素(E2,P,T,LH)分泌變化。(2)對照組在動情間期,實驗組在同一時間手術(shù)切除卵巢,第7天12:00~15:00,每10分鐘眼眶靜脈取血一次共3小時,血清進(jìn)行LH放免測定,了解LH分泌的頻率和振幅變化。
　　4.在出生后小鼠70日的晚上8時開始禁食,次日上午8時按3g葡萄糖/kg體重的劑量灌服50%葡萄糖液,灌糖后分別在0、30、60、1

15、20min鼠尾尖取血,采用血糖儀檢測血糖,放免檢測法胰島素。
　　結(jié)果:
　　1.卵巢切除后EB刺激,其PgR mRNA表達(dá)情況比較:各組老鼠卵巢切除后,EB刺激,對照組PgRmRNA(1.2112±0.2355)表達(dá)量高于實驗T組(0.5017±0.3234)和DHT組(0.4123±0.2876),均P<0.05。
　　2.(1)出生后各組仔鼠AGD。對照組與實驗T組、DHT組間分別比較:PND2(依次為:1.4±

16、0.1 vs1.6±0.1,1.4±0.1 vs1.7±0.1,均P<0.01);PND22(依次為10.5±0.4 vs14.2±1.1,10.5±0.4 vs14.9±0.5,均P<0.01);PND60(依次為15.1±0.5 vs19.1±0.4,15.1±0.5 vs19.0±0.3,均P<0.01)。但實驗組間比較:PND2(依次為:1.6±0.1 vs1.7±0.1, P>0.05);PND22(依次為14.2±1.1 v

17、s14.9±0.5,P>0.05);PND60(依次為19.1±0.4 vs19.0±0.3,P>0.05)。(2)出生后各組仔鼠PND13乳暈檢查。對照組與實驗T組、DHT組間比較:正常乳暈數(shù)(11.9±0.3 vs1.5±0.5,11.9±0.3 vs1.3±0.5,均P<0.05)。實驗組間(1.5±0.5 vs1.3±0.5,P>0.05)?？?cè)闀灁?shù)(12±0.0 vs2.8±0.8,12±0.0 vs2.4±0.7, P<0.

18、05);實驗組間(2.8±0.8 vs2.4±0.7,P>0.05)。
　　3.(1)激素測定結(jié)果。對照組分別與實驗組(T組,DHT組)比較:依次分別為E2(15.3±0.5vs23.0±1.2,15.3±0.5 vs23.0±1.2,P<0.05)(ng/ml);P(15.3±0.7 vs24.7±0.6,15.3±0.7 vs24.7±2.1, P<0.05)(ng/ml);LH(0.44±0.07 vs0.77±0.07,0

19、.44±0.07 vs0.76±0.07,P<0.05)(ng/ml),三種激素比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。T(0.019±0.007 vs0.021±0.008,0.019±0.007 vs0.024±0.008,P>0.05)(ng/ml),對照組與實驗組T水平比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組間各組激素對應(yīng)比較,均P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。(2)各組大鼠LH分泌頻率和幅度測定。觀察發(fā)現(xiàn):實驗T組大鼠與對照組相比,頻率增加,幅度更大;但實驗DHA

20、組由于實驗原因沒有得出類似結(jié)果。
　　4.妊娠期雄激素過高及正常組大鼠OGTT結(jié)果比較。三組空腹血糖分別為(4.4±0.2 vs4.4±0.3,4.4±0.2 vs4.3±0.2,P>0.05)(mmol/L);1h血糖(7.43±0.21 vs7.45±0.22,7.43±0.21 vs7.31±0.34,P>0.05)(mmol/L);2h血糖(6.18±0.14 vs6.18±0.14,6.18±0.14 vs6.06±0.

21、20, P>0.05)(mmol/L)。三組空腹胰島素分別為(13.9±1.0 vs14.2±0.6,13.9±1.0 vs14.2±1.0, P>0.05)(mU/L);2h胰島素(12.0±0.7 vs11.5±0.8,12.0±0.7 vs11.9±1.0,P>0.05)(mU/L)。
　　結(jié)論:
　　1.正常雌鼠E2給予能夠誘導(dǎo)PgR mRNA的表達(dá)產(chǎn)生LH峰,妊娠期雄激素過高大鼠(T組和DHT組)E2給予誘導(dǎo)產(chǎn)生P

22、gR mRNA減少,PgR mRNA分泌的減少進(jìn)而導(dǎo)致下丘腦分泌GnRH減少,從而不產(chǎn)生LH峰。與PCOS患者LH分泌異常、稀發(fā)排卵或不排卵癥狀一致,這抑或是PCOS排卵障礙的原因之一。
　　2.妊娠期雄激素過高大鼠AGD明顯增加,乳頭數(shù)明顯減少,出現(xiàn)假兩性畸形。與人類有關(guān)疾病發(fā)生相似,如孕期使用雄激素及合成的孕激素:可致女性假兩性畸形。但PCOS患者很少出現(xiàn)有外生殖器雄性化改變。分析原因:由于晚成雛哺乳動物,如SD大鼠,出生時外

23、生殖器和神經(jīng)系統(tǒng)處于分化發(fā)育中期,出生前后幾天時間內(nèi)生殖器對雄激素反應(yīng)敏感,因此這類哺乳動物,在妊娠晚期暴露過多雄激素,生殖器雄性化;而人類,雄激素對生殖器的雄性化作用的敏感時間僅持續(xù)到妊娠中期。
　　3.妊娠期雄激素過高大鼠:表現(xiàn)出LH分泌量和頻率均增加,動情周期改變(周期延長)。與PCOS患者月經(jīng)失調(diào)癥狀,以及LH/FSH比值高相似,推測可能與PCOS患者妊娠期雄激素過高有關(guān)。
　　4.妊娠期雄激素過高大鼠糖代謝變化無異