健康成人肝臟線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的構(gòu)建和mRNA-蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性影響因素的多元回歸分析.pdf

1、線(xiàn)粒體作為細(xì)胞的產(chǎn)能中心、代謝中心和凋亡中心，在生命過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理功能，并且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對(duì)線(xiàn)粒體的研究由來(lái)已久，但對(duì)其功能和蛋白質(zhì)構(gòu)成仍未完全清楚。蛋白質(zhì)表達(dá)譜構(gòu)建(profiling)作為高通量、規(guī)?；难芯糠椒?，從整體上研究某一生理或病理狀態(tài)下線(xiàn)粒體所有蛋白質(zhì)，為從蛋白質(zhì)水平詮釋線(xiàn)粒體功能及其在疾病中的作用機(jī)制提供新的方法。 本研究利用聯(lián)合提取細(xì)胞器的方法，提取高純度的肝臟線(xiàn)粒體，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和純度

2、評(píng)價(jià)。其蛋白質(zhì)表達(dá)譜的構(gòu)建，采用SDS-PAGE結(jié)合nano-LC-ESI-MS/MS的技術(shù)策略，并引入質(zhì)譜分段掃描的分離模式(GPF)。經(jīng)反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)價(jià)，確定95％可信度、雙肽段匹配(95P2)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)。為了明確所鑒定蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，我們采用逐步遞進(jìn)的數(shù)據(jù)判定方法。首先，以期望最大化法(EM)校正的肽段定量為基礎(chǔ)，用最鄰近算法(KNN)來(lái)進(jìn)行分類(lèi)；其次，在KNN基礎(chǔ)上，用結(jié)合其它六種生物信息學(xué)方法(NUCLEO)的貝葉斯模型對(duì)所

3、鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞器定位劃分，其定位預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性可達(dá)到81％。最終得到線(xiàn)粒體定位的非冗余蛋白質(zhì)774個(gè)，其中96個(gè)屬于蛋白質(zhì)新定位，291個(gè)屬于新定位蛋白質(zhì)。這是目前人肝臟能夠得到明確線(xiàn)粒體定位蛋白質(zhì)的最大數(shù)據(jù)集，將作為一種資源用于人類(lèi)肝臟的其它研究。對(duì)于規(guī)?；牡鞍踪|(zhì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，我們采用GO分類(lèi)系統(tǒng)及Pfam結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)功能的發(fā)掘和注釋。根據(jù)GO生物過(guò)程的注釋?zhuān)覀冭b定的蛋白質(zhì)主要參與三大物質(zhì)代謝及能量代謝，綜合其它細(xì)胞器鑒

4、定數(shù)據(jù)的GO超幾何分析結(jié)果也與線(xiàn)粒體的功能一致，很好的詮釋了線(xiàn)粒體的功能，表明了肝臟線(xiàn)粒體作為機(jī)體代謝中心和“能量工廠(chǎng)”的生理特點(diǎn)。在387個(gè)明確定位于線(xiàn)粒體的蛋白質(zhì)中，只有28個(gè)與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，超幾何分析結(jié)果顯示信號(hào)傳導(dǎo)功能在肝臟線(xiàn)粒體中明顯缺失(p<0.001)。25個(gè)新定位于線(xiàn)粒體的信號(hào)類(lèi)蛋白質(zhì)對(duì)我們進(jìn)一步研究線(xiàn)粒體與其它細(xì)胞器間或線(xiàn)粒體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)有新的提示作用。其中，G蛋白是G蛋白偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，以前普遍認(rèn)為它

5、只定位在細(xì)胞膜的內(nèi)表面，最近有其在細(xì)胞核膜新定位的報(bào)道。8個(gè)G蛋白亞基的線(xiàn)粒體定位，提示G蛋白也可能介導(dǎo)跨線(xiàn)粒體膜的信號(hào)傳遞，因而可能有助于我們重塑G蛋白偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)表達(dá)譜的構(gòu)建至關(guān)重要，95P2及99P1(99％可信度、單肽段以上匹配)是目前國(guó)家上認(rèn)可的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)。本研究在人肝臟7次重復(fù)鑒定的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，計(jì)算不同Nobsb1(每個(gè)蛋白質(zhì)可觀(guān)測(cè)到的肽段數(shù))范圍蛋白質(zhì)在95P2數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)下被單次實(shí)驗(yàn)鑒定的可能性，

6、發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)鑒定的均值(8.9％)相比，低Nobsbl蛋白質(zhì)被鑒定的可能性只有0.85％(Nobsbl<35)，相差懸殊。雖然采用95P2數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)可以比99P1多約25％的數(shù)據(jù)量，但是對(duì)于低Nobsbl值范圍的蛋白質(zhì)，采用95P2數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于99P1，這與蛋白質(zhì)在質(zhì)譜中的鑒定受其理化性質(zhì)影響有關(guān)。該結(jié)果一方面可以解釋我們數(shù)據(jù)中參與氧化磷酸化蛋白質(zhì)其鑒定率非常低的問(wèn)題；另一方面也有助于在以后的蛋白質(zhì)組研究中分析低Nobsbl值

7、蛋白質(zhì)的假陰性鑒定問(wèn)題。根據(jù)中心法則，mRNA(轉(zhuǎn)錄組)和蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組)是基因表達(dá)的不同層面，由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的存在，二者在表達(dá)豐度上并不完全一致。兩種數(shù)據(jù)的綜合考慮一方面有助于全面了解生物的功能狀態(tài)；另一方面有助于區(qū)分真正的mRNA/蛋白質(zhì)豐度一致或不一致性。對(duì)二者相關(guān)性影響因素的分析，有助于我們摒棄數(shù)據(jù)中的噪音干擾，清晰展現(xiàn)mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的規(guī)律。關(guān)于mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的研究較多，但結(jié)論頗有爭(zhēng)議。對(duì)二者相關(guān)性的影

8、響因素分析多側(cè)重于生物學(xué)方面，較少考慮技術(shù)層面的原因，且多為定性描述。本研究提出一個(gè)蛋白質(zhì)鑒定的技術(shù)指標(biāo)：RIPpro(蛋白質(zhì)相對(duì)鑒定可能性)，并對(duì)其合理性進(jìn)行了較全面的評(píng)估。在此基礎(chǔ)上，對(duì)RIPpro等多種影響mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的因素進(jìn)行了回歸分析。發(fā)現(xiàn)RIPpro變化可以影響蛋白質(zhì)豐度變化的11％、mRNA/蛋白質(zhì)相關(guān)性變化的5％。通過(guò)對(duì)mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)系數(shù)的分級(jí)呈現(xiàn)，總數(shù)據(jù)其二者相關(guān)性是0.59，75％的數(shù)據(jù)其二者

9、相關(guān)性為0.75，有力駁斥了關(guān)于mRNA/蛋白質(zhì)豐度毫無(wú)相關(guān)性的說(shuō)法。對(duì)明顯偏離mRNA/蛋白質(zhì)豐度趨勢(shì)線(xiàn)的蛋白質(zhì)的功能及理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)代謝類(lèi)蛋白質(zhì)的定量多高于其mRNA預(yù)測(cè)豐度，且RIPpro越低此現(xiàn)象越明顯；信號(hào)相關(guān)類(lèi)蛋白質(zhì)的定量多低于其mRNA預(yù)測(cè)豐度。這可能與兩類(lèi)蛋白質(zhì)在肝臟中的功能活躍程度及我們?cè)谘芯恐胁捎肗obsbl校正肽段計(jì)數(shù)的蛋白質(zhì)組定量方法有關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)RIPpro在mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性研究中的確作為

10、干擾因素存在。根據(jù)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)注釋?zhuān)黠@偏離tuRN/蛋白質(zhì)豐度趨勢(shì)線(xiàn)的94個(gè)(5％)蛋白質(zhì)中有95.7％為疾病相關(guān)蛋白質(zhì)，校正RIPpro的影響因素后，我們可能從中選取受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控多的蛋白質(zhì)作為候選的治療靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)24個(gè)功能類(lèi)別蛋白質(zhì)mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的分析，發(fā)現(xiàn)代謝類(lèi)蛋白質(zhì)mRNA/蛋白質(zhì)相關(guān)系數(shù)明顯高于信號(hào)類(lèi)蛋白質(zhì)，代謝類(lèi)蛋白質(zhì)豐度的變化40％由其轉(zhuǎn)錄本豐度變化導(dǎo)致，而信號(hào)類(lèi)蛋白質(zhì)豐度的變化只有17％

11、由其轉(zhuǎn)錄本豐度變化引起，22％由RIPpro的變化引起。這一結(jié)果提示代謝類(lèi)蛋白質(zhì)受到的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控較少，代謝類(lèi)基因持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，對(duì)機(jī)體從節(jié)能的角度講是合理的；而信號(hào)類(lèi)蛋白質(zhì)mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性差一方面由于其多為小分子的低豐度蛋白質(zhì)，采用質(zhì)譜定量引入較多的誤差所致(22.38％)，其次可能受到較多的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這對(duì)以前把不同功能類(lèi)別蛋白質(zhì)二者相關(guān)性的差異籠統(tǒng)歸結(jié)為受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控程度不同的說(shuō)法是一種補(bǔ)充。 綜上所述，本研究提出細(xì)

12、胞器聯(lián)合提取的策略，在此基礎(chǔ)上形成中國(guó)人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃中細(xì)胞器提取的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范(SOP)。首次成功構(gòu)建人類(lèi)肝臟線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜，結(jié)合貝葉斯模型對(duì)所鑒定蛋白質(zhì)給出了相對(duì)明確的定位判斷，蛋白質(zhì)新定位對(duì)其功能研究提供新的參考信息。在蛋白質(zhì)組/轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)對(duì)接中，首次提出RIPpro的技術(shù)指標(biāo)，對(duì)影響mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的多種因素進(jìn)行分析，將回歸的定量研究方法引入到mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)系數(shù)影響因素的挖掘上來(lái)。這對(duì)于其它規(guī)模化數(shù)