化學(xué)合成經(jīng)修飾抗TIMP-2siRNA防治肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：①針對(duì)大鼠金屬蛋白酶組織抑制劑-2（tissue inhibitor of metalloproteinase -2，TIMP-2）mRNA序列設(shè)計(jì)和篩選化學(xué)合成經(jīng)修飾抗TIMP-2小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）；②研究化學(xué)合成經(jīng)修飾抗TIMP-2 siRNA對(duì)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSCs）合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matri

2、x, ECM）的影響；③研究TIMP-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（membrane type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）在活化HSCs中的表達(dá)及對(duì)ECM合成分泌的影響；④研究化學(xué)合成經(jīng)修飾抗TIMP-2 siRNA對(duì)四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)和膽總管結(jié)扎大鼠肝纖維化

3、模型的影響。 方法：①以膠原酶和鏈酶蛋白酶E原位灌流梯度離心法分離純化HSCs；②以不同濃度和在不同時(shí)間點(diǎn)將化學(xué)合成經(jīng)修飾抗TIMP-2 siRNA轉(zhuǎn)染活化HSCs，篩選基因沉默效率較高的一對(duì)；③檢測(cè)抗TIMP-2 siRNA對(duì)大鼠HSCs活化增殖、合成分泌ECM等生物學(xué)特性的影響；④檢測(cè)抗TIMP-2 siRNA對(duì)HSCs合成分泌MMP-2、MT1-MMP和MMP-13水平的變化；⑤將篩選出一對(duì)化學(xué)合成抗TIMP-2 siRN

4、A分別導(dǎo)入CCl4誘導(dǎo)和膽總管結(jié)扎兩種肝纖維化動(dòng)物模型；⑥檢測(cè)肝功能、血清纖維化標(biāo)志物和肝組織羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量、HSCs活化指標(biāo)、ECM合成與降解指標(biāo)和肝細(xì)胞增殖指標(biāo)，評(píng)價(jià)其對(duì)大鼠肝纖維化的影響。 結(jié)果：①siRNA_687對(duì)TIMP-2基因的沉默效率高于siRNA_366。在活化HSCs中應(yīng)用化學(xué)合成經(jīng)修飾抗TIMP-2 siRNA后，各siRNA組a-平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-smooth mu

5、scle actin，α-SMA）、I型膠原（collagen type I，COL I）和III型膠原（collagen type III，COL III）的表達(dá)顯著降低，且培養(yǎng)細(xì)胞上清液中透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、III型前膠原（procollagen type III，PC III）和Hyp的含量也隨之減少；②應(yīng)用化學(xué)合成經(jīng)修飾抗TIMP-2 siRNA后，TIMP-2、MMP-2、MT1-MMP、COL

6、I和COL III的表達(dá)明顯降低，而MMP-13的表達(dá)則明顯增加，培養(yǎng)細(xì)胞上清液中HA、PCIII和Hyp的含量也明顯減少；③在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型中，各治療組在應(yīng)用抗TIMP-2 siRNA治療后組織學(xué)病變減輕，門靜脈壓（portal vein pressure，PVP）降低，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，

7、AST）、HA、層粘連蛋白（laminin，LN）、PCIII、IV型膠原（collagen type IV，COL IV）和肝組織Hyp均顯著低于模型組，且TIMP-2、MMP-2、COL I、COL III、α-SMA的表達(dá)也明顯減少，肝細(xì)胞增殖明顯；④在膽總管結(jié)扎肝纖維化動(dòng)物模型中，經(jīng)抗TIMP-2 siRNA干預(yù)后，大鼠肝臟組織學(xué)病變減輕，PVP降低，血清ALT和AST水平下降，肝組織Hyp含量減少，且TIMP-2、COL I和

8、COL III mRNA的表達(dá)顯著低于模型組，TIMP-2蛋白的表達(dá)也顯著降低。同時(shí)HSCs標(biāo)記物α-SMA和結(jié)蛋白（desmin）的表達(dá)均顯著低于模型組，尤以α-SMA蛋白表達(dá)減少更為明顯。 結(jié)論：①化學(xué)合成經(jīng)修飾抗TIMP-2 siRNA能夠高效抑制TIMP-2的表達(dá)，減少HSCs分泌合成ECM，抑制HSCs活化；②TIMP-2通過(guò)MT1-MMP介導(dǎo)MMP-2的活化；抑制TIMP-2的表達(dá)，MT1-MMP和MMP-2的表達(dá)隨