兩株海綿來源真菌抗腫瘤活性成分研究及宏基因新技術在海綿共附生菌中應用初探.pdf

1、海綿共附生微生物因其次級代謝產(chǎn)物結構新穎、活性獨特，目前已成為抗腫瘤藥物研究的重要資源。本文對兩株海綿來源的抗腫瘤活性真菌黃灰青霉Penicillium auratiogriseum(Sp－19)和菌株CTFS－15的抗腫瘤活性次級代謝產(chǎn)物進行了較系統(tǒng)地研究。此外，本文還對利用宏基因技術從未培養(yǎng)海綿共附生微生物中尋找生物活性代謝產(chǎn)物的方法進行了初步探索。 對黃灰青霉P．a(chǎn)uratiogriseum(Sp－19)和菌株CTFS－1

2、5分別進行大量發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取得粗提物；采用人慢性髓性白血病K562細胞，以細胞增殖抑制活性結果為分離向導，采用減壓硅膠柱層析、凝膠柱層析(SephadexLH－20)、反相硅膠柱層析(RP-18)和反相制備高效液相(HPLC)等分離手段，從兩株真菌的乙酸乙酯提取物中分離得到27個化合物；利用理化性質和光譜學方法(uv、IR、MS、1D-NMR和2D-NMR)鑒定了其中23個化合物。其中分離自黃灰青霉P.auratiogris

3、eum的18個化合物分別為：Auratiomide A(1)，Auratiomide C(2)，Anacine(3)，F(xiàn)ructigeninesA(4)，F(xiàn)ructigenines B(5)，PseurotinA(6)，青霉菌素(7)，青霉菌醇(8)，Viridicatol(9)，3-甲氧基4-苯基喹啉酮(10)，3-甲基喹唑啉酮(11)，(2s，4S)-2,4,8一trihydroxy-3，4-dihydronaphthalen-1(

4、2H)-one(12)，( 2S，4R)-2,4,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2h)-one(13)，(3R，4R)-3,4,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one(14)，麥角甾醇(15)，N-(2-羥苯基)乙酰胺(16)，N-(2-(甲氨基)苯基)乙酰胺(17)和大黃素(18)；分離自菌株CTFS-15的5個化合物分別為：過氧化麥角甾醇(

5、19)，對羥基苯乙酰胺(20)，7-羥基-4-甲氧基-5-甲基香豆素(21)，環(huán)-(丙-亮)(22)，靛紅(23)。 利用人(K562、A549、BEL．7402、HL-60)及小鼠(tsFT210、P388)腫瘤細胞，以細胞增殖抑制率、細胞凋亡誘導和細胞周期抑制活性為指標，應用流式細胞術、SRB等方法對分離得到的化合物進行抗腫瘤活性的初步評價。結果表明，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、ll、12、13、14、16、23對

6、K562細胞具有不同程度的細胞增殖抑制活性，化合物15、19對tsFT210細胞具有強烈的壞死性細胞毒活性。進一步研究表明，化合物8、20對K562細胞具有細胞凋亡誘導活性，化合物3、18對K562細胞具有細胞周期的G<,0>／G<,1>期抑制活性，化合物23對P388細胞具有細胞周期的G<,2>／M期抑制活性。其中，化合物7、8、11、12、13、14、16、20、23對K562細胞的活性為首次報道；化合物23對P388細胞的G<,2

7、>／M期抑制活性為首次報道。對于黃灰青霉Pauratiogriseum，生物堿類化合物1、2、3、4、5、6、7、8、ll和四氫萘酮類化合物12、13、14是其抗腫瘤活性的主要結構類型。對于菌株CTFS-1 5，化合物19、20、23是其主要抗腫瘤活性成分。 在利用宏基因技術開拓未培養(yǎng)海綿共附生微生物藥用資源的研究中，直接提取海綿共附生微生物基因組DNA構建了轉基因工程菌，從中隨機篩選到2株能夠抑制四聯(lián)球菌生長的工程菌，利用高壓

8、液相色譜對其代謝產(chǎn)物進行了分析，結果顯示，工程菌的高壓液相指紋圖譜與宿主菌的存在明顯差別，這說明工程菌中產(chǎn)生了不同于宿主菌的代謝產(chǎn)物。以上結果證明了通過宏基因技術構建工程菌來尋找未培養(yǎng)海綿共附生微生物活性代謝產(chǎn)物這一新途徑從方法學和實驗技術上來說都是可行的。 綜上，本文通過對兩株海綿來源真菌的次級代謝產(chǎn)物進行研究，初步闡明了黃灰青霉P. auratiogriseum(Sp-19)和菌株CTFS-15抗腫瘤活性的物質基礎，確定了活