基于宏基因組的海綿及其共附生微生物功能基因(簇)研究.pdf

1、2007年上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文基于宏基因組的海綿及其共附生微生物功能基因（簇）研究姓名：張戌升系所：生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系專業(yè)：微生物學(xué)研究方向：海洋功能基因?qū)W習(xí)年限：2005.09～2007.06學(xué)位級(jí)別：工學(xué)碩士指導(dǎo)老師：李志勇教授二零零七年六月基于宏基因組的海綿及其共附生微生物功能基因（簇）研究摘要1950年以來(lái)，人們從海綿中發(fā)現(xiàn)了大量活性物質(zhì)，使海綿成為海洋活性物質(zhì)最豐富的來(lái)源。越來(lái)越多研究表明一些活性物質(zhì)是由海綿共附生

2、微生物產(chǎn)生的，但是還缺乏直接的證據(jù)。我們前期研究已經(jīng)篩選到多株具有抗菌活性的海綿共附生微生物，開(kāi)展相關(guān)功能基因研究，從基因水平揭示這些抗菌活性的分子基礎(chǔ)具有重要價(jià)值。同時(shí)，由于絕大多數(shù)海綿共附生微生物屬于難培養(yǎng)微生物，因此建立宏基因組文庫(kù)將為利用難培養(yǎng)的海綿共附生微生物功能基因資源意義正大。盡管已有從海綿及其共附生微生物中分離得到具有抗腫瘤、抗菌等活性的聚酮化合物和非核糖體多肽的報(bào)道，但海綿及其共附生微生物中這兩類化合物的合成基因（簇）

3、研究非常少。本文目的在于利用宏基因組技術(shù)從海綿及其共附生微生物中篩選到聚酮合成酶(PKS)基因（簇）和非核糖體多肽合成酶(NRPS)基因（簇），為所發(fā)現(xiàn)的抗菌活性提供分子基礎(chǔ)，為海綿活性物質(zhì)微生物來(lái)源假說(shuō)提供證據(jù)，同時(shí)建立包含大片段DNA的海綿宏基因組文庫(kù)為基因步從海綿中直接篩選相關(guān)功能基因簇提供基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明細(xì)薄星芒海綿(Stellettatenui)共附生緩慢葡萄球菌A75具有廣譜抗菌活性。本文提取緩慢葡萄球菌A75基因組

4、DNA建立了Fos宏基因組文庫(kù)，文庫(kù)的插入片段在2543kb之間。采用基于功能基因的PCR篩選技術(shù)和基于功能的抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)宏基因組文庫(kù)進(jìn)行了篩選，得到了一個(gè)針對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制活性的陽(yáng)性克隆。采用酶切測(cè)序、拼接的方法獲得了一條長(zhǎng)約26kb的核苷酸序列。對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該序列含有較為完整的約21.8kb的PKS基因簇，將其翻譯成氨基酸序列后進(jìn)行功能域分析，發(fā)現(xiàn)包含了DH、AT、ACP、KS、KR五個(gè)系列共22個(gè)功能域基因，推測(cè)該基因簇