棉花(Gossypium hirsutum)PYL基因的分離與鑒定.pdf

1、棉花是非常重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在世界各地都有種植。棉花的主產(chǎn)品棉纖維是一種天然的紡織纖維，是紡織工業(yè)的重要原材料。在棉花生長(zhǎng)發(fā)育中，常常出現(xiàn)一些不利的環(huán)境條件，例如干旱、水澇、低溫、高鹽等。這些不利的環(huán)境因素嚴(yán)重影響棉花正常生長(zhǎng)，造成減產(chǎn)減收。如何提高棉花品種對(duì)上述不良環(huán)境的抗性是目前各國(guó)研究人員關(guān)注的問(wèn)題，其中通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)向棉花基因組中引入新的抗逆基因是一種非常具有前景的策略。
　　脫落酸(ABA)是一種植物激素，ABA核心信

2、號(hào)通路在植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ABA受體PYL蛋白、負(fù)調(diào)控因子A類(lèi)PP2C蛋白、正調(diào)控因子SnRK2s蛋白和下游的效應(yīng)因子共同組成了一條完整的ABA核心信號(hào)通路。對(duì)棉花中編碼這些蛋白的基因進(jìn)行克隆鑒定和功能研究，有助于更好地理解棉花ABA信號(hào)通路，從而為棉花抗逆基因的篩選鑒定提供線(xiàn)索。
　　本文在棉花基因組中分離了27個(gè)編碼棉花ABA的受體PYL蛋白的基因，命名為GhPYLI-27，對(duì)這些PYL基因及其編碼蛋白進(jìn)行

3、了序列與進(jìn)化分析、組織表達(dá)和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析，以及它們與PP2C蛋白的相互作用及轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析等，主要結(jié)果如下:
　　1、棉花PYL基因的分離鑒定和序列結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析
　　依據(jù)與擬南芥PYL蛋白的序列相似性，我們從棉花基因組中分離了27個(gè)GhP YL基因，這些基因的ORF長(zhǎng)約600bp，編碼的氨基酸數(shù)目在200個(gè)左右，在一些二級(jí)結(jié)構(gòu)上非常保守。依據(jù)與擬南芥PYL蛋白的同源性可將其分為三個(gè)亞組。
　　2、棉花PYL

4、基因的組織表達(dá)和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析
　　分析了其中9個(gè)GhP YL基因在棉花組織中的表達(dá)譜，結(jié)果顯示它們具有不同的組織表達(dá)模式。GhPYL1在根、下胚軸、子葉中的表達(dá)量相對(duì)較高，GhPYL8、GhPYL12在根中強(qiáng)烈表達(dá)，而GhPYL26在各組織中表達(dá)量相差不大。利用定量RT-PCR技術(shù)對(duì)5個(gè)棉花PYL基因(GhPYL1、GhP YL8、GhPYL10、GhPYL12和GhPYL26)的表達(dá)進(jìn)行了定量分析，研究它們是否在干旱脅迫下誘

5、導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示在晉棉13號(hào)受到干旱脅迫后，這5個(gè)GhPYL基因均出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)。
　　3、棉花PYL蛋白與PP2C蛋白在酵母中的相互作用
　　將GhPYL基因構(gòu)建到AD載體，GhPP2C基因構(gòu)建到BD載體，轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明GhPYL8、GhPYL10、GhPYL12、GhPYL22、GhPYL25和GhPYL26蛋白能夠與棉花PP2C蛋白在酵母中發(fā)生相互作用，并且這種相互作用具有選擇性。
　　4、

6、GhPYL1蛋白的亞細(xì)胞定位分析
　　構(gòu)建GFP∶GhPYL1融合蛋白表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。在共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗根部細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GFP應(yīng)該主要分布在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，這表明GhPYL1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
　　5、過(guò)量表達(dá)GhPYL轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA的敏感性分析
　　構(gòu)建GhPYL10、GhPYL12、GhP YL26的過(guò)量表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南

7、芥，獲得轉(zhuǎn)基因株系。統(tǒng)計(jì)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在含ABA的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和綠苗率發(fā)現(xiàn)，3個(gè)GhPYL基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥相比野生型均萌發(fā)更慢，幼苗生長(zhǎng)受到ABA更嚴(yán)重的抑制，說(shuō)明過(guò)量表達(dá)GhPYLs增加了擬南芥在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)ABA的敏感性。
　　6、過(guò)量表達(dá)GhPYL轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)NaCl的敏感性分析
　　統(tǒng)計(jì)野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的轉(zhuǎn)基因擬南芥在含NaCl的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率

8、和綠苗率發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)GhPYL10和GhPYL12轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率和綠苗率比野生型更低，而過(guò)量表達(dá)GhPYL26轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率低于野生型。
　　7、過(guò)量表達(dá)GhPYL轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)甘露醇的敏感性分析
　　統(tǒng)計(jì)野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的轉(zhuǎn)基因擬南芥在含甘露醇的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和綠苗率，結(jié)果顯示野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的的萌發(fā)率和綠苗率沒(méi)有顯著差異。
　　8、過(guò)量表達(dá)GhP YL轉(zhuǎn)基因