棉花Ca2+轉(zhuǎn)運相關基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、植物細胞膜Ca2+主動運輸體系主要包括CAX與Ca2+-ATPase兩大類，它們負責將植物細胞內(nèi)多余的Ca2+轉(zhuǎn)到液泡或者運出胞外，以維持胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)平衡。研究表明，CAX與Ca2+-ATPase在植物對冷、鹽脅迫及離子毒害等逆境的抗性反應中起著正向或負向調(diào)控作用。有關CAX的調(diào)控機制目前尚不清楚，但有研究報道它可與一些調(diào)控蛋白，如CXIP類蛋白，結合并被激活。
　　 利用RACE技術從棉花品系“YZ-1”中克隆出GhCA

2、X1、GhCAX3和GhCXIP2等參與Ca2+轉(zhuǎn)運的基因。構建了GhCAX1、Gh CAX3、GhCXIP2和GhACA2等基因的RNAi干涉載體并轉(zhuǎn)化“YZ-1”。另外構建了這些基因的超量表達載體并分別轉(zhuǎn)化“YZ-1”、酵母或煙草，并對轉(zhuǎn)基因酵母和轉(zhuǎn)基因煙草進行了分子鑒定和逆境脅迫處理。取得的主要研究結果如下：
　　 1.首次在棉花中克隆出了GhCAX1、GhCAX3和GhCXIP2這3個基因。用生物信息學軟件對GhCAX1

3、和GhCAX3進行了蛋白二級結構和氨基酸序列比對分析。發(fā)現(xiàn)GhCAX1，GhCAX3均具有屬于跨膜蛋白的典型跨膜結構域。它們的N端可能含有一段自我抑制結構域。將GhCAX1，GhCAX3和其N端自我抑制域缺失基因(sGhCAX1，sGhCAX3)分別轉(zhuǎn)化Ca2+敏感酵母突變體菌株‘K667’。鑒定發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)N端自我抑制域缺失基因的酵母能在含高濃度Ca2+的YPD培養(yǎng)基上生長，證明GhCAX1，GhCAX13的N端均具有自我抑制結構域，通

4、常條件下并不具備Ca2+轉(zhuǎn)運活性。
　　 2.研究意外發(fā)現(xiàn)HA標簽表達的多肽與GhCAX3在酵母菌株‘k667’中共表達后能恢復菌株的Ca2+轉(zhuǎn)運能力，表明HA多肽可能通過與GhCAX3的N端結構域互作而激活GhCAX3轉(zhuǎn)運Ca2+轉(zhuǎn)的功能。
　　 3.對全長或截短形式的GhCAX1和GhCAX3基因重組‘K667’進行250mMLiCl和冷脅迫處理，發(fā)現(xiàn)sGhCAX1和sGhCAX3轉(zhuǎn)基因酵母分別對LiCl，冷脅迫的抗

5、性增強，而GhCAX3重組酵母對兩種脅迫的抗性均有所增強。我們初步推測GhCAX1和GhCAX3可能具有Li+轉(zhuǎn)運功能，另外，GhCAX3還參與了冷脅迫誘導的Ca2+信號轉(zhuǎn)導。對轉(zhuǎn)GhCAX1，GhCAX3或sGhCAX1，sGhCAX3的T1代煙草幼苗進行150mM NaCl脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草對鹽脅迫的抗性均有所增強，初步推斷GhCAX1和GhCAX3在煙草中可能也具有轉(zhuǎn)運Na+的功能或參與鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導。
　　 4.對

6、GhCAX1和GhCAX3在煙草中異源表達后具有Ca2+轉(zhuǎn)運活性，并引起植株葉片卷曲，芽心發(fā)黃等形態(tài)異常的可能原因進行了探討。
　　 5.共獲得約85株不同基因的RNAi及超表達的T0代棉花單株，其中11個獲得了T1代轉(zhuǎn)基因家系。
　　 綜合以上結果，GhCAX1和GhCAX3的N端含有自我抑制結構域，其蛋白在酵母中不能被激活。HA標簽對GhCAX3的Ca2+轉(zhuǎn)運活性有激活作用。GhCAX1和GhCAX3的異源表達可以提