棉花Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、植物細(xì)胞膜Ca2+主動(dòng)運(yùn)輸體系主要包括CAX與Ca2+-ATPase兩大類，它們負(fù)責(zé)將植物細(xì)胞內(nèi)多余的Ca2+轉(zhuǎn)到液泡或者運(yùn)出胞外，以維持胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡。研究表明，CAX與Ca2+-ATPase在植物對(duì)冷、鹽脅迫及離子毒害等逆境的抗性反應(yīng)中起著正向或負(fù)向調(diào)控作用。有關(guān)CAX的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，但有研究報(bào)道它可與一些調(diào)控蛋白，如CXIP類蛋白，結(jié)合并被激活。
　　 利用RACE技術(shù)從棉花品系“YZ-1”中克隆出GhCA

2、X1、GhCAX3和GhCXIP2等參與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的基因。構(gòu)建了GhCAX1、Gh CAX3、GhCXIP2和GhACA2等基因的RNAi干涉載體并轉(zhuǎn)化“YZ-1”。另外構(gòu)建了這些基因的超量表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)化“YZ-1”、酵母或煙草，并對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了分子鑒定和逆境脅迫處理。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.首次在棉花中克隆出了GhCAX1、GhCAX3和GhCXIP2這3個(gè)基因。用生物信息學(xué)軟件對(duì)GhCAX1

3、和GhCAX3進(jìn)行了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和氨基酸序列比對(duì)分析。發(fā)現(xiàn)GhCAX1，GhCAX3均具有屬于跨膜蛋白的典型跨膜結(jié)構(gòu)域。它們的N端可能含有一段自我抑制結(jié)構(gòu)域。將GhCAX1，GhCAX3和其N端自我抑制域缺失基因(sGhCAX1，sGhCAX3)分別轉(zhuǎn)化Ca2+敏感酵母突變體菌株‘K667’。鑒定發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)N端自我抑制域缺失基因的酵母能在含高濃度Ca2+的YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，證明GhCAX1，GhCAX13的N端均具有自我抑制結(jié)構(gòu)域，通

4、常條件下并不具備Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)活性。
　　 2.研究意外發(fā)現(xiàn)HA標(biāo)簽表達(dá)的多肽與GhCAX3在酵母菌株‘k667’中共表達(dá)后能恢復(fù)菌株的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力，表明HA多肽可能通過(guò)與GhCAX3的N端結(jié)構(gòu)域互作而激活GhCAX3轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+轉(zhuǎn)的功能。
　　 3.對(duì)全長(zhǎng)或截短形式的GhCAX1和GhCAX3基因重組‘K667’進(jìn)行250mMLiCl和冷脅迫處理，發(fā)現(xiàn)sGhCAX1和sGhCAX3轉(zhuǎn)基因酵母分別對(duì)LiCl，冷脅迫的抗

5、性增強(qiáng)，而GhCAX3重組酵母對(duì)兩種脅迫的抗性均有所增強(qiáng)。我們初步推測(cè)GhCAX1和GhCAX3可能具有Li+轉(zhuǎn)運(yùn)功能，另外，GhCAX3還參與了冷脅迫誘導(dǎo)的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)轉(zhuǎn)GhCAX1，GhCAX3或sGhCAX1，sGhCAX3的T1代煙草幼苗進(jìn)行150mM NaCl脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽脅迫的抗性均有所增強(qiáng)，初步推斷GhCAX1和GhCAX3在煙草中可能也具有轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的功能或參與鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 4.對(duì)

6、GhCAX1和GhCAX3在煙草中異源表達(dá)后具有Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，并引起植株葉片卷曲，芽心發(fā)黃等形態(tài)異常的可能原因進(jìn)行了探討。
　　 5.共獲得約85株不同基因的RNAi及超表達(dá)的T0代棉花單株，其中11個(gè)獲得了T1代轉(zhuǎn)基因家系。
　　 綜合以上結(jié)果，GhCAX1和GhCAX3的N端含有自我抑制結(jié)構(gòu)域，其蛋白在酵母中不能被激活。HA標(biāo)簽對(duì)GhCAX3的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)活性有激活作用。GhCAX1和GhCAX3的異源表達(dá)可以提