兩個(gè)棉花(Gossypium hirsutum)LIM蛋白調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及其在花藥發(fā)育中的功能研究.pdf

1、肌動(dòng)蛋白(actin)在真核生物的生命活動(dòng)中占據(jù)重要地位，它不僅是構(gòu)建細(xì)胞骨架所必需的物質(zhì)，而且也參與了真核生物生長(zhǎng)發(fā)育中的很多過(guò)程。一旦肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)機(jī)制遭到破壞，真核生物的生命活動(dòng)就會(huì)出現(xiàn)不同程度的畸變。在細(xì)胞中，一系列的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(ABP)參與了維持肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)及其功能多樣性。
　　LIM蛋白作為一類重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在很多植物中均有報(bào)道。它參與調(diào)控肌動(dòng)蛋白絲的裝配與解聚過(guò)程，包括成核、切割和成帽等。

2、在棉花中，先前有報(bào)道指出，該類蛋白參與棉纖維發(fā)育調(diào)控過(guò)程的調(diào)控，但對(duì)于LIM蛋白在棉花花藥發(fā)育中的功能研究卻鮮有報(bào)道。本文對(duì)兩個(gè)在棉花花藥中高量表達(dá)的LIM蛋白基因(命名為GhPLIM1和GhPLIM2)進(jìn)行了克隆鑒定，并對(duì)其編碼蛋白的相關(guān)生化功能進(jìn)行了分析，獲得如下研究結(jié)果:
　　1、GhPLIM1和GhPLIM2蛋白的亞細(xì)胞定位分析
　　為研究GhPLIM1和GhPLIM2在棉花花藥發(fā)育中的功能，探究GhPLIM1和Gh

3、PLIM2蛋白是否也如其他LIM家族蛋白一樣能夠與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，構(gòu)建了pBI121-GhPLIM1-GFP和pMD-GhPLIM2-GFP融合蛋白表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化棉花，觀察轉(zhuǎn)基因棉花愈傷細(xì)胞，均可以觀測(cè)到GFP熒光。在共聚焦顯微鏡下觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，GhPLIM1-GFP不僅分布在細(xì)胞質(zhì)中，也具有細(xì)胞核定位信號(hào)。在細(xì)胞質(zhì)中，GhPLIM1-GFP形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)狀分布，同時(shí)GhPLIM1-GFP熒光信號(hào)也在細(xì)胞核中

4、有一定的積累。GhPLIM2具有與GhPLIM1類似的亞細(xì)胞定位。這說(shuō)明GhPLIM1和GhPLIM2蛋白都可能是F-actin結(jié)合蛋白，且在細(xì)胞核中也有分布。
　　2、GhPLIM1和GhPLIM2蛋白能夠與肌動(dòng)蛋白絲相互作用
　　分別構(gòu)建pET-28a-GhPLIM1和pET-28a-GhPLIM2原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，原核表達(dá)純化GhPLIM1和GhPLIM2蛋白。將表達(dá)純化的LIM蛋白與F-acti

5、n進(jìn)行高速共沉淀實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果顯示GhPLIM1和GhPLIM2蛋白均可與F-actin相互作用，形成相對(duì)分子質(zhì)量較大的復(fù)合物，從而能在高速離心力的作用下沉降下來(lái)。
　　3、GhPLIM1和GhPLIM2蛋白能夠使肌動(dòng)蛋白絲成束
　　通過(guò)濃縮后的GhPLIM1和GhPLIM2蛋白與F-actin進(jìn)行低速共沉淀實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果顯示F-actin、GhPLIM1和GhPLIM2均單獨(dú)存在時(shí)，低速離心力均不能使其沉淀下來(lái)。而在F-a

6、ctin中加入GhPLIM1或GhPLIM2蛋白后，F(xiàn)-actin與GhPLIM1或GhPLIM2都可以結(jié)合并離心沉降下來(lái)。這說(shuō)明GhPLIM1和GhPLIM2均可以使F-actin成束，使其相對(duì)分子質(zhì)量增加，從而在低速離心力的作用下也能被沉降下來(lái)。
　　4、GhPLIM1蛋白能夠穩(wěn)定F-actin細(xì)胞骨架
　　將不同濃度的GhPLIM1蛋白與F-actin一起孵育，之后加入LatB(一種F-acin抑制劑，能夠使actin

7、絲解聚)，通過(guò)高速共沉淀實(shí)驗(yàn)使上清和沉淀分離。結(jié)果顯示，未經(jīng)過(guò)LatB處理時(shí)，F(xiàn)-actin絕大部分分布于沉淀中。加入LatB后，部分F-actin被解聚，分布于上清中。之后再加入GhPLIM1蛋白，能夠抑制LatB對(duì)F-actin的解聚作用，并且隨著GhPLIM1蛋白濃度的逐漸升高，其穩(wěn)定F-actin的作用越明顯。
　　5、棉花遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因棉花植株的鑒定
　　除上述兩個(gè)LIM家族基因外，本文也對(duì)棉花GhWLIM5基因