大鼠心肌梗死區(qū)移植細(xì)胞長(zhǎng)期存活及誘導(dǎo)型NOS干預(yù)研究.pdf

1、目的：通過(guò)細(xì)胞移植修復(fù)梗死心肌，誘導(dǎo)血管新生，改善心臟功能，成為當(dāng)今倍受關(guān)注的課題。然而，移植細(xì)胞早期大量喪失的問(wèn)題限制了其生物學(xué)功能的發(fā)揮。為此，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將雄性SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植于雌性SD大鼠心肌梗死模型，觀察移植后細(xì)胞存活的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化及其分布情況，初步探討細(xì)胞移植后影響細(xì)胞長(zhǎng)期存活的因素，在此基礎(chǔ)上，提出在眾多炎癥因子中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)激活，生成高濃度的一氧化氮，可能是影響移植細(xì)胞長(zhǎng)期

2、存活的主要因素之一，并通過(guò)進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討心肌梗死后iNOS表達(dá)的變化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，采用對(duì)照研究分析細(xì)胞移植后早期干預(yù)iNOS活性對(duì)移植細(xì)胞長(zhǎng)期存活率的影響，為臨床應(yīng)用干細(xì)胞移植治療心肌梗死與優(yōu)化治療方案提供必要的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：1、急性心肌梗死(AMI)模型制備：取清潔雌性SD大鼠，體重150-180g，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制備AMI模型，1小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞移植，隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察；2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMS

3、Cs)制備：取100～130g雄性SD大鼠，分離、純化、培養(yǎng)其BMSCs。分離純化的大鼠BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定及免疫組化檢測(cè)；3、細(xì)胞移植：于AMI后1小時(shí)，直視下將1.2×106個(gè)培養(yǎng)的BMSCs注射植入到梗死區(qū)中心心外膜下；4、AMI后iNOS表達(dá)規(guī)律檢測(cè)：免疫印跡法檢測(cè)心肌梗死后1天、3天、7天、10天、14天梗死區(qū)的iNOS表達(dá)情況；5、移植細(xì)胞定位檢測(cè)：以Brdu或Hoechst33342標(biāo)記定位觀察移植細(xì)胞，并與HE染色

4、對(duì)照；6、移植細(xì)胞定量檢測(cè)：采用Real-time PCR檢測(cè)大鼠Y染色體雄性鑒別基因sry片段的表達(dá)，作為移植細(xì)胞存活率的定量比較指標(biāo)。
　　 結(jié)果：1、方法學(xué)：結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支后，左室壁變蒼白，收縮減弱，左心耳充血，與未缺血區(qū)界線清楚，表明AMI動(dòng)物模型復(fù)制成功；分離純化的大鼠BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定為CD44+/CD34-，免疫組化檢測(cè)有CD44表達(dá)，而無(wú)CD34表達(dá)，證明擬移植細(xì)胞為BMSCs。2、移植后不同時(shí)

5、間的細(xì)胞存活觀察：依據(jù)細(xì)胞移植后取材時(shí)間分為3組：一周組—細(xì)胞移植后1周取材；三周組—細(xì)胞移植后3周取材；六周組—細(xì)胞移植后6周取材。各組組織冰凍切片熒光顯微鏡下均可觀察到大量Hoechst33342標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，三周組、六周組可見標(biāo)記細(xì)胞部分聚集形成血管樣結(jié)構(gòu)；各組HE染色和Brdu免疫組織化學(xué)檢測(cè)均可見有核呈棕色的陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞集中分布；Real-time PCR檢測(cè)六周組細(xì)胞存活率(8.73％)，一周組(7.88％)，三周組(7.8

6、2％)(n=8，p＞0.05)，提示移植后一周至六周移植細(xì)胞不再有進(jìn)行性減少。3、AMI后不同時(shí)間心肌組織iNOS表達(dá)規(guī)律：AMI后不同時(shí)間點(diǎn)iNOS表達(dá)的強(qiáng)度變化規(guī)律為：3天＞1天＞7天＞10天＞14天(n=6，p＜0.05)，提示在第1至3天為iNOS表達(dá)高峰。4、選擇性iNOS抑制劑對(duì)移植細(xì)胞長(zhǎng)期存活的保護(hù)作用：實(shí)驗(yàn)組于移植后12h給予選擇性iNOS抑制劑1400W，2mg/kg，腹腔注射，2次/天，維持4天，細(xì)胞移植后6周取材；

7、對(duì)照組給予等量生理鹽水，其余同實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果可見干預(yù)iNOS活性的實(shí)驗(yàn)組中Brdu標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞分布集中，周邊未標(biāo)記的炎癥細(xì)胞明顯減少，部分血管內(nèi)皮上明顯可見Brdu標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。相鄰切片、相同部位的HE染色可見移植細(xì)胞的相似分布，核呈藍(lán)紫色，核大，染色深。Real-time PCR檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Y染色體sry序列的表達(dá)水平分別為8.75％、6.63％，提示抑制iNOS活性可明顯增加移植細(xì)胞存活率(n=7，p＜0.05)。