心肌干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌梗死心電生理影響的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究目的是:了解大鼠CSCs電生理特性,觀察CSCs移植后對(duì)大鼠心肌梗死心電生理的影響。
　　 第1章心肌干細(xì)胞的分離,培養(yǎng),鑒定與誘導(dǎo)分化CSCs在心肌組織中數(shù)量極少。選擇一個(gè)有效的操作簡(jiǎn)便的體外分離純化的方法,在CSCs研究中尤為重要。本實(shí)驗(yàn)部分應(yīng)用貼壁分離法對(duì)CSCs進(jìn)行體外分離、純化培養(yǎng)和鑒定,并對(duì)CSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。
　　 1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?建立大鼠CSCs體外分離培養(yǎng)方法,為下一步研究CSCs離子通道和

2、觀察CSCs移植對(duì)大鼠心肌梗死心電生理的影響提供充足細(xì)胞資源。
　　 1.2材料與方法:取新生Sprague Dawley(SD)大鼠,在無菌條件下取心臟組織,采取貼壁分離和消化控制相結(jié)合辦法分離純化CSCs,觀察細(xì)胞形態(tài)變化。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原:c-kit,CD29,CD90.1,CD11b/c,CD34,CD45的表達(dá),進(jìn)行CSCs鑒定。以及應(yīng)用心肌球培養(yǎng)液誘導(dǎo)CSCs分化,并行細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè):肌鈣蛋白Ⅰ、α-

3、肌動(dòng)蛋白和結(jié)合蛋白。
　　 1.3結(jié)果
　　 1.3.1 Po(原代)及P1代(經(jīng)過1次傳代為P1代,如此類推)細(xì)胞常有雜質(zhì)細(xì)胞。P2及P3代時(shí),得到較純的CSCs。
　　 1.3.2流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示:c-kit,CD29,CD90.1為陽(yáng)性,CD11b/c,CD34,CD45為陰性。
　　 1.3.3 CSCs誘導(dǎo)分化結(jié)果:CSCs經(jīng)培養(yǎng)液誘導(dǎo)2周后,細(xì)胞免疫化學(xué)染色肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac t

4、roponinⅠ)、結(jié)合蛋白(desmin)和α-肌動(dòng)蛋白(α-SarcomericActin)為陽(yáng)性。
　　 1.4小結(jié)
　　 CSCs可以從心肌中分離,進(jìn)行體外培養(yǎng)增殖。并且可以在體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。
　　 第2章心肌干細(xì)胞離子通道m(xù)RNA的表達(dá)與電流的檢測(cè)由于干細(xì)胞存在致心律失常性可能,干細(xì)胞的電生理特性成為研究熱點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)表明:CSCs分化為心肌細(xì)胞后,表現(xiàn)出和心室肌近似的電生理特性。然

5、而,大鼠CSCs在未分化為心肌細(xì)胞的狀態(tài)下,其離子通道表達(dá)和電生理特性尚不明了。
　　 2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過對(duì)CSCs離子通道m(xù)RNA表達(dá)和INa,Ica,Ito的檢測(cè),了解CSCs離子通道表達(dá)進(jìn)程和細(xì)胞電生理特性,為以后研究提供重要的實(shí)驗(yàn)資料。
　　 2.2材料和方法:取P3代CSCs,提取RNA。予以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)CSCs離子通道KCNN3,CCHL2a,Kit2.1,Kv4.3,Kv3.1

6、,Kv2.1,Kv1.6,Kv1.3和rScn2a1的mRNA表達(dá)。膜片鉗全細(xì)胞記錄模式記錄CSCs是否存在INa,Ica,Ito電流。
　　 2.3結(jié)果
　　 2.3.1 CSCs離子通道m(xù)RNA:CCHL2a強(qiáng)表達(dá),Kv4.3、Kv3.1中度表達(dá),Kv2.1、Kv1.6、Kv1.3、Kir2.1低表達(dá),KCNN3和rScn2a1極低表達(dá)。
　　 2.3.2膜片鉗全細(xì)胞記錄模式未檢測(cè)出CSCs存在INa,Ica

7、,Ito。
　　 2.4小結(jié)
　　 CSCs在未分化為心肌細(xì)胞的狀態(tài)下,已有離子通道m(xù)RNA的表達(dá),但是膜片鉗全細(xì)胞記錄模式未檢測(cè)出離子電流存在。
　　 第3章心肌干細(xì)胞移植后對(duì)大鼠心肌梗死心電生理的影響隨著生物工程學(xué)發(fā)展,CSCs的發(fā)現(xiàn)和成功分離,使之成為新的研究熱點(diǎn)。CSCs移植被認(rèn)為是治療心臟性疾病最好的種子細(xì)胞之一。實(shí)驗(yàn)也顯示:CSCs移植后,對(duì)心肌梗死動(dòng)物的心功能有明顯的改善,但是對(duì)心電生理的影響卻甚少

8、文獻(xiàn)報(bào)道。所以本實(shí)驗(yàn)旨在觀察CSCs移植后對(duì)心肌梗死大鼠心電生理的影響。
　　 3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?觀察CSCs移植后對(duì)大鼠心肌梗死心電生理的影響。
　　 3.2材料與方法:26只雄性SD大鼠,建立心肌梗死模型,其中20只建模成功。2周后,20只心肌梗死大鼠隨機(jī)分為2組,每組10只,分別為心肌干細(xì)胞移植組和對(duì)照組(PBS組)。心肌干細(xì)胞移植組大鼠予以梗死區(qū)心肌內(nèi)注射CSCs(5×106/0.1 ml)0.1ml,對(duì)照組大鼠予

9、以梗死區(qū)心肌內(nèi)注射PBS0.1ml。6周后檢測(cè)以下數(shù)據(jù):心室有效不應(yīng)期,心外膜單極電圖激動(dòng)恢復(fù)時(shí)間與激動(dòng)恢復(fù)時(shí)間離散度,惡性室性心律失常誘發(fā)率,室顫閾值(VFT)和心肌梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)CSCs縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達(dá)。
　　 3.3結(jié)果
　　 3.3.1在程序電刺激S1S2,S1S2S3條件下,CSCs移植后,對(duì)心室有效不應(yīng)期影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.3.2 CSCs移植后,梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)的

10、校正激動(dòng)恢復(fù)時(shí)間明顯縮短,校正激動(dòng)恢復(fù)時(shí)間離散度明顯下降。
　　 3.3.3 CSCs移植后,心肌干細(xì)胞移植組更難誘發(fā)惡性室性心律失常。
　　 3.3.4.CSCs移植后,梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)VFT明顯提高。
　　 3.3.5CSCs移植組在大鼠梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)都可檢測(cè)到Cx43表達(dá),并且與移植的細(xì)胞定位重疊。PBS組大鼠梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)Cx43表達(dá)極少。
　　 3.4小結(jié)
　　 3.

11、4.1 CSCs移植后,可以改善心肌梗死大鼠電生理異常狀態(tài),提高VFT。
　　 3.4.2 CSCs移植后,能夠在定植區(qū)表達(dá)Cx43。
　　 全文結(jié)論
　　 1 CSCs可以從心肌中分離,進(jìn)行體外培養(yǎng)增殖。并且可以在體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。
　　 2 CSCs在未分化為心肌細(xì)胞的狀態(tài)下,已有離子通道m(xù)RNA的表達(dá),但是膜片鉗全細(xì)胞記錄模式未檢測(cè)出離子電流存在。
　　 3 CSCs移植后,可以改善心