氫氧化鈣抑制牙髓卟啉單胞菌脂多糖骨破壞作用研究.pdf

1、目的：
　　牙髓卟啉單胞菌（porphyromonas endodontalis，P.e）作為急性根尖周病損的特異性檢出菌，與牙髓病和根尖周病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，在菌體增殖或死亡時其胞壁釋放出主要毒力因子-脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可以刺激成骨細(xì)胞分泌多種炎癥因子并最終導(dǎo)致骨質(zhì)吸收。氫氧化鈣（Calcium hydroxide，CH）作為臨床最常用的根管消毒藥物，因可解離出羥基離子而呈強(qiáng)堿性，對根

2、尖周病的多種厭氧菌具有較強(qiáng)的抑制及殺滅作用，但由于革蘭氏式陰性厭氧菌在死亡時會崩解出LPS貼附于根管壁及根管側(cè)枝甚至于溢出根尖周，以繼續(xù)發(fā)揮促炎及骨破壞作用，所以氫氧化鈣對革蘭氏陰性厭氧菌的LPS活性有無良好的抑制作用值得深入研究。本實驗旨在研究P.e LPS對成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的作用，并檢測氫氧化鈣是否可以抑制P.e LPS對骨組織的破壞作用。
　　材料和方法：
　　1、細(xì)菌培養(yǎng)和LPS的提取與鑒定
　　將P.e接種

3、于腦心浸液（Brain heart infusion）固體培養(yǎng)基，在37℃、厭氧條件下（含80％N2、10％CO2、10％H2）培養(yǎng)。采用熱酚水法提取P.e LPS，應(yīng)用凝膠鱟試劑對所提取的脂多糖進(jìn)行定性分析。
　　2、氫氧化鈣溶液的制備
　　將200 mg氫氧化鈣干粉溶于50 ml三蒸水中，劇烈震蕩10 min后，1000 g離心10 min，收集上清液，經(jīng)直徑0.22μm的濾器過濾后，以此做為氫氧化鈣母液(體積分?jǐn)?shù)為10

4、0％)，備用。
　　3、細(xì)胞培養(yǎng)
　　小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1和小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW264.7生長于含10％胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml鏈霉素的MEM-α的培養(yǎng)基中，置于含5％CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長良好的對數(shù)期細(xì)胞，進(jìn)行實驗。
　　4、P.e LPS活性分析
　　用去熱源水將P.e LPS濃度倍比稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-

5、7和10-8μg/ml，各濃度組加入15％氫氧化鈣溶液，對照組加入等體積的去熱源水，于37℃孵育6h（將氫氧化鈣與P.e LPS作用6h后的混合液記為CH-P.e LPS），顯色基質(zhì)法鱟試驗檢測P.e LPS的活性。
　　5、細(xì)胞活性分析
　　MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板，密度為2×103個/孔。分別加入氫氧化鈣、P.e LPS及CH-P.e LPS作用細(xì)胞1、3、5d后，MTT法檢測細(xì)胞活性。
　　6、RNA提

6、取及反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分析
　　氫氧化鈣與P.e LPS在體外37℃下作用2、6、18及24h后，再將二者混合液加入MC3T3-E1細(xì)胞作用6h，到達(dá)作用時間后，使用Trizol（Invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，使用RT-PCR(Takara)試劑盒行反轉(zhuǎn)錄及PCR，檢測IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)。
　　7、免疫熒光
　　MC3T3-E1細(xì)胞計數(shù)后接種在盛有無菌玻片(直徑為18mm)的培養(yǎng)皿內(nèi)

7、過夜生長，制取細(xì)胞爬片。加入P.e LPS及CH-P.e LPS作用30 min，3.7％的甲醛固定細(xì)胞，NF-κB抗體于4℃下孵育過夜，二抗孵育40 min，封片后于熒光顯微鏡下檢測。
　　8、Western blot分析
　　將P.e LPS及CH-P.e LPS加入MC3T3-E1細(xì)胞作用30 min，使用凱基蛋白提取試劑盒分離細(xì)胞核蛋白及胞質(zhì)蛋白，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，4℃孵育NF-κB抗體過夜，二抗孵育4

8、h，ECL試劑盒檢測NF-κB蛋白表達(dá)。
　　將P.e LPS及CH-P.e LPS加入RAW264.7細(xì)胞作用6、24或36h，裂解細(xì)胞，抗NFATc1抗體4℃孵育過夜，二抗孵育4h，ECL試劑盒檢測NFATc1蛋白表達(dá)。將P.e LPS及CH-P.e LPS加入RAW264.7細(xì)胞作用30或60 min，裂解細(xì)胞，p-p38、p38、p-ERK和ERK抗體4℃孵育過夜，二抗孵育4h，ECL試劑盒檢測p-p38、p38、p-ER

9、K和ERK的表達(dá)。
　　9、熒光素酶檢測
　　NF-κB報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞或RAW264.7細(xì)胞，孵育4h后，將培養(yǎng)液更換為含10％胎牛血清的MEM-α的培養(yǎng)液孵育24 h，加入P.e LPS及CH-P.e LPS作用細(xì)胞1h，采用Dual-Glo(R) Luciferase試劑盒檢測NF-κB熒光素酶活性。
　　10、抗酒石酸酸性磷酸酶檢測
　　P.e LPS或CH-P.e LPS作用RAW2

10、64.7細(xì)胞4d，室溫下將RAW264.7細(xì)胞用梓檬酸鹽/丙酮溶液固定30s，抗酒石酸酸性磷酸酶染色，光鏡觀察抗酒石酸酸性磷酸酶陽性多核破骨細(xì)胞（≥5個核）。
　　向出生3d的Balb/c小鼠頭蓋骨區(qū)域連續(xù)注射超純水、氫氧化鈣、P.e LPS及CH-P.e LPS12 d，處死小鼠，解剖分離頭蓋骨，用梓檬酸鹽/丙酮溶液固定頭蓋骨30s，抗酒石酸酸性磷酸酶染色，觀察頭蓋骨染色飽和度。
　　11、微型計算機(jī)斷層成像(μCT)

11、r>　　小鼠頭蓋骨的藥物注射同上，解剖分離頭蓋骨，固定，采用μCT分析骨密度，并進(jìn)行三維重建。
　　12、Masson-Goldner三色法染色和組織學(xué)分析
　　小鼠頭蓋骨的藥物注射同上，解剖分離頭蓋骨，將分離的頭蓋骨用石蠟包埋，制成4μm切片，Masson-Goldner試劑盒行三色法染色，顯微鏡下觀察頭蓋骨的組織學(xué)變化。
　　13、統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式記錄，每次實驗至少重復(fù)3次。

12、建立數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學(xué)差異標(biāo)記為*(P＜0.05)和**(P＜0.01)。
　　結(jié)果：
　　1、P.e LPS活性及純度分析
　　凝膠鱟試驗結(jié)果顯示最小濃度10 ng/ml P.e LPS即具有內(nèi)毒素活性，且所提取的P.e LPS無蛋白及核酸污染。
　　2、氫氧化鈣抑制P.e LPS活性
　　不同濃度的P.e LPS與15％氫氧化鈣體外37℃作用6h后，活性均顯著下降。
　　3、氫

13、氧化鈣消除P.e LPS對成骨細(xì)胞活性的抑制
　　10μg/mlPeLPS作用MC3T3-E1細(xì)胞1、3、5d后，細(xì)胞活性逐漸下降，若10μg/ml P.e LPS與15％氫氧化鈣作用6h后(CH-P.e LPS)，則不再抑制MC3T3-E1細(xì)胞活性。
　　4、氫氧化鈣抑制P.e LPS介導(dǎo)的成骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　(1)、P.e LPS作用MC3T3-E1細(xì)胞6h后，IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量顯著增加;若P.

14、e LPS與15％氫氧化鈣體外作用2、6、18、及24 h再加入MC3T3-E1細(xì)胞作用6h，則IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量逐漸下降
　　(2)、P.e LPS作用MC3T3-E1細(xì)胞30 min，引起NF-κB的核移位及細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)的升高;若CH-P.e LPS加入MC3T3-E1細(xì)胞作用30 min，則無明顯NF-κB的核移位及細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白的表達(dá)。
　　(3)、P.e LPS作用MC3T3

15、-E1細(xì)胞1h，NF-κB的熒光素酶活性顯著升高，相比之下，CH-P.e LPS作用MC3T3-E1細(xì)胞1h，NF-κB的熒光素酶活性相對下降。
　　5、氫氧化鈣抑制P.e LPS介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成
　　(1)、P.e LPS作用RAW264.7細(xì)胞4d，破骨細(xì)胞生成顯著增加;若CH-P.e LPS作用RAW264.7細(xì)胞4d，破骨細(xì)胞生成相對下降。
　　(2)、P.e LPS作用RAW264.7細(xì)胞6、24及36h，

16、NFATc1蛋白表達(dá)量升高且于24 h達(dá)到高峰;若CH-P.e LPS作用RAW264.7細(xì)胞6、24及36h，NFATc1蛋白表達(dá)量在各時間點都相對下降。
　　(3)、P.e LPS作用RAW264.7細(xì)胞1h，NF-κB熒光素酶活性升高;若CH-P.eLPS作用RAW264.7細(xì)胞1h，NF-κB的熒光素酶活性相對下降。
　　(4)、P.e LPS作用RAW264.7細(xì)胞30或60 min，p-p38和p-ERK蛋白表達(dá)

17、量增加;若CH-P.e LPS作用RAW264.7細(xì)胞30或60 min，p-p38和p-ERK蛋白表達(dá)量都相對下降。
　　6、氫氧化鈣抑制P.e LPS介導(dǎo)的骨破壞
　　(1)、連續(xù)12d向小鼠頭蓋骨區(qū)域注射P.e LPS或CH-P.e LPS，P.e LPS促進(jìn)了頭蓋骨破骨細(xì)胞生成，CH-P.e LPS則相對抑制了破骨細(xì)胞生成。
　　(2)、P.e LPS顯著降低了頭蓋骨區(qū)域的骨密度，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞;CH-P.e L

18、PS則相對增加了頭蓋骨區(qū)域的骨密度，抑制了骨質(zhì)破壞。
　　(3)、P.e LPS降低了頭蓋骨骨層厚度，導(dǎo)致骨細(xì)胞減少;CH-P.e LPS則相對增加了骨層厚度、未礦化骨質(zhì)增多。
　　結(jié)論：
　　1、氫氧化鈣逆轉(zhuǎn)P.e LPS對成骨細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　2、氫氧化鈣抑制P.e LPS對成骨細(xì)胞NF-κB的激活，減弱P.e LPS刺激細(xì)胞表達(dá)IL-6和TNF-α炎癥因子的能力。
　　3、氫氧化鈣抑制P.e