SIRT1對牙髓卟啉單胞菌脂多糖誘導的成骨細胞中MMP--13表達的調(diào)控作用.pdf

1、慢性根尖周炎(chronic apical periodontitis，CAP)是一種以炎癥性肉芽組織形成和骨質(zhì)破壞為主要病理特征的疾病，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在慢性根尖周炎的炎癥發(fā)展和骨病損擴散中發(fā)揮重要作用。MMP-13屬于MMPs家族，是一種間質(zhì)膠原酶，可由成骨細胞、巨噬細胞、漿細胞分泌，在慢性根尖周炎的骨吸收中起著關鍵作用，且與根尖周肉芽腫向根尖囊腫的轉化關系密切。牙髓卟啉單

2、胞菌（Porhyromonas endodontalis，P.e）的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是根尖周炎癥的強刺激因素，我們的前期研究已證明P.e LPS誘導成骨細胞產(chǎn)生白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-23、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和Wnt5a等多種炎癥因子，其中IL-6、M-CSF和Wnt5a

3、的表達與核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路有關，我們還證明了P.e LPS刺激成骨細胞后有效地激活了NF-κB信號通路。然而，關于P.e LPS誘導成骨細胞中MMP-13表達的情況及是否與NF-κB信號通路有關未見報道。
　　SIRT1是廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi)的一種蛋白，是沉默信息調(diào)節(jié)因子(sirtuin，SIRT)蛋白質(zhì)家族的一員，它是Ⅲ類組蛋白去乙?；?，在脂代謝、糖代謝以及調(diào)節(jié)胰島素分泌中

4、發(fā)揮重要作用。近幾年，學者們開始探索SIRT1在炎癥反應中的作用，發(fā)現(xiàn)SIRT1在各種組織細胞中發(fā)揮了良好的抗炎作用。SIRT1主要的抗炎機制之一就是它能通過去乙?；饔糜贜F-κB的p65亞基，抑制NF-κB下游靶基因的轉錄，進而減少IL-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等炎癥因子的產(chǎn)生。然而，在成骨細胞中，SIRT1是否參與調(diào)控P.e LPS誘導的慢性根尖周炎相關炎癥因子的表

5、達以及SIRT1是否參與調(diào)控P.e LPS激活的NF-κB信號通路仍不清楚。
　　目的:
　　觀察P.e LPS對小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞MMP-13mRNA表達和MMP-13蛋白分泌水平的影響，以及NF-κB信號通路在P.e LPS誘導小鼠成骨細胞MMP-13表達中的作用;探索P.e LPS作用的小鼠成骨細胞中SIRT1蛋白的變化及SIRT1是否參與了MMP-13表達的調(diào)控，以及SIRT1蛋白對NF-κB信號通路的

6、調(diào)控作用。以期為研究慢性根尖周炎根尖區(qū)骨破壞的發(fā)生發(fā)展機制提供依據(jù)，同時為炎癥性骨破壞尋找新的治療靶點。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)(P.e)，提取LPS，并鑒定。
　　2、培養(yǎng)MC3T3-E1細胞。
　　3、運用實時逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，real-time PCR)檢測不同濃度、不同作用時間的P.e

7、LPS刺激MC3T3-E1細胞后MMP-13在mRNA水平表達的變化;分別用Bay11-7082(NF-κB抑制劑)、白藜蘆醇(resveratrol，RES)（SIRT1激動劑）、EX-527（SIRT1抑制劑）預處理細胞后，再用P.e LPS刺激，檢測MMP-13mRNA表達的變化。
　　4、運用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-like immunosorbent assay，ELISA）檢測不同作用時間的P.e LPS刺激M

8、C3T3-E1細胞后MMP-13蛋白分泌水平的變化;檢測分別用Bay11-7082、白藜蘆醇、EX-527預處理細胞后，再用P.e LPS刺激，MMP-13蛋白分泌水平的變化。
　　5、運用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)技術，檢測P.e LPS刺激MC3T3-E1細胞0-48h后SIRT1蛋白表達的變化;分別用白藜蘆醇、EX-527預處理細胞后，再用P.e LPS刺激細胞，SIRT1蛋白表達的變化以及NF-κB乙?；降?/p>

9、變化。
　　6、用雙螢光素酶報告基因(Dual luciferase reporter gene)系統(tǒng)檢測白藜蘆醇、EX-527對MC3T3-E1細胞NF-κB轉錄活性的影響。
　　7、用染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)的方法，檢測P.e LPS是否能促使NF-κBp65亞基與MMP-13啟動子結合，同時確定MC3T3-E1細胞中MMP-13啟動子上的NF-κBp65亞基

10、的結合位點;分別用白藜蘆醇、EX-527預處理細胞后，再用P.e LPS刺激細胞，觀察白藜蘆醇和EX-527對NF-κBp65亞基與MMP-13啟動子結合的影響。
　　結果:
　　1、P.e LPS誘導MC3T3-E1細胞MMP-13的表達增多，且隨著P.e LPS刺激強度的增大，MMP-13基因的轉錄水平和MMP-13蛋白分泌水平也增加。
　　2、NF-κB以正調(diào)節(jié)方式參與了P.e LPS誘導MC3T3-E1細胞表達

11、MMP-13的過程。(1)用NF-κB抑制劑BAY11-7028預處理MC3T3-E1細胞后，P.e LPS誘導的MMP-13mRNA表達減少，且MMP-13蛋白分泌減少;(2)20μg/ml P.e LPS刺激MC3T3-E1細胞1h，促使NF-κBp65亞基綁定于與MMP-13啟動子的-400～-200bp區(qū)域。
　　3、SIRT1蛋白以負調(diào)節(jié)方式參與了P.e LPS誘導MC3T3-E1細胞表達MMP-13的過程。(1)P.e

12、 LPS刺激MC3T3-E1細胞引起細胞內(nèi)SIRT1蛋白水平降低，且呈現(xiàn)時間依賴性;白藜蘆醇（SIRT1激動劑）預處理MC3T3-E1細胞，使細胞內(nèi)SIRT1蛋白增加，EX-527(SIRT1抑制劑)預處理使SIRT1蛋白減少;(2)用SIRT1激動劑白藜蘆醇預處理MC3T3-E1細胞后，P.e LPS誘導的MMP-13mRNA表達和蛋白分泌水平均減少，而SIRT1抑制劑EX-527則作用相反。
　　4、SIRT1抑制了P.e L

13、PS刺激的MC3T3-E1細胞中NF-κB的轉錄活性，抑制了NF-κBp65與MMP-13啟動子的結合，并降低了NF-κBp65亞單位的乙?；?。(1)白藜蘆醇使P.e LPS誘導的MC3T3-E1細胞中NF-κB轉錄活性降低，EX-527使NF-κB轉錄活性升高;(2)白藜蘆醇抑制了P.e LPS誘導的MC3T3-E1細胞中NF-κBp65與MMP-13啟動子的結合，EX-527則促進了NF-κBp65與MMP-13啟動子的結合;(