牙髓卟啉單胞菌脂多糖刺激人牙周膜細(xì)胞表達(dá)Il-23的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　比較慢性根尖周炎病損組織及健康牙周膜組織中IL-23的表達(dá)水平，檢測(cè)P.endodontalis LPS刺激人牙周膜細(xì)胞系SH-9細(xì)胞后IL-23的表達(dá)、NF-κB信號(hào)通路的變化及P.endodontalis LPS刺激SH-9細(xì)胞的條件培養(yǎng)液對(duì)RAW264.7分化破骨細(xì)胞的作用，探討IL-23在根尖周炎發(fā)病機(jī)制中的重要作用。
　　方法:
　　一、病例選擇
　　取得患者的知情同意后，收集22例經(jīng)臨床和

2、X線確診為慢性根尖周炎并且需要拔除的患牙的根尖周病損組織，22例因正畸要求拔除的健康牙齒牙周膜組織作為對(duì)照樣本。
　　二、H-E染色
　　樣本制備成組織厚度4μm的石蠟切片，切片放入二甲苯溶液中脫蠟。蘇木精水溶液中染色5分鐘，伊紅染色液染色2-3min，染色后的切片經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。
　　三、免疫組織化學(xué)染色
　　組織切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，羊血封閉，切片滴加一抗、二抗，應(yīng)用DAB試劑盒顯色，

3、蘇木素復(fù)染，封片，鏡檢。
　　四、細(xì)胞培養(yǎng)
　　將SH-9細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的α-MEM的培養(yǎng)基中，置于含5％CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　五、實(shí)時(shí)定量PCR
　　提取組織及細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒及7500 Real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，每個(gè)

4、基因做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，反應(yīng)結(jié)果以相對(duì)值表示。
　　六、Western blot
　　收集細(xì)胞后加入Lysate buffer裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，測(cè)濃度，蛋白變性，進(jìn)行凝膠電泳，孵育一抗、二抗，應(yīng)用ECL試劑盒發(fā)光。
　　七、免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　細(xì)胞經(jīng)固定，通透，BSA封閉，加入一抗、熒光二抗及細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡下觀察。
　　八、熒光素酶檢測(cè)
　　應(yīng)用Lipofectamine LT

5、X試劑將pNF-κB-luc熒光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，加入P.endodontalis LPS刺激細(xì)胞30min后，收集并裂解細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。
　　九、小干擾RNA轉(zhuǎn)染
　　應(yīng)用Lipofectamine LTX試劑將IL-23的小干擾RNA轉(zhuǎn)染至SH-9細(xì)胞中，非特異性小干擾RNA作為對(duì)照組。
　　十、抗酒石酸酸性磷酸酶染色
　　P.endodontalis LPS刺激SH-9細(xì)胞36小時(shí)后的條件培養(yǎng)液加

6、入至RAW264.7細(xì)胞中，并加入RANKL(10ng/mL)培養(yǎng)48h，進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。
　　十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示。兩樣本比較采用T檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:
　　1、IL-23 mRNA在慢性根尖周炎病損組織中表達(dá)高于健康對(duì)照組。
　　2、P.endod

7、ontalis LPS通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)SH-9細(xì)胞表達(dá)IL-23。
　　(1)P.endodontalis LPS誘導(dǎo)SH-9細(xì)胞表達(dá)IL-23 mRNA呈時(shí)間依賴性。
　　(2) Bay11-7082抑制P.endodontalis LPS誘導(dǎo)的SH-9細(xì)胞表達(dá)IL-23。
　　(3)P.endodontalis LPS誘導(dǎo)SH-9細(xì)胞NF-κB的核易位及p-IκB的表達(dá)增加。
　　(4)P.en

8、dodontalis LPS提高SH-9細(xì)胞NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　3、P.endodontalis LPS刺激IL-23基因沉默的SH-9細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可抑制破骨細(xì)胞分化。
　　結(jié)論:
　　1、在慢性根尖周炎病損組織內(nèi)可檢測(cè)到IL-23，且表達(dá)量顯著高于正常牙周膜組織，推測(cè)IL-23可能參與根尖周炎的發(fā)病過(guò)程。
　　2、P.endodontalis LPS通過(guò)激活SH-9細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)IL