新生大鼠高氧性肺損傷肺組織中AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的蛋白和mRNA表達(dá)及沐舒坦的干預(yù)作用.pdf

1、目的：通過建立新生大鼠急性高氧性肺損傷模型及使用沐舒坦干預(yù)并與正常新生大鼠對(duì)比：
　　1.觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況、肺組織的病理學(xué)改變；
　　2.研究各實(shí)驗(yàn)組之間肺組織中水通道蛋白-1（AQP1）、鈉鉀ATP酶α1亞基(Na+-K+-ATPaseα1)、鈉鉀氯共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（NKCC1）的表達(dá)變化，以探討AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1在急性高氧性肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用；
　　3.探討沐舒坦對(duì)急

2、性高氧性肺損傷是否有保護(hù)作用及是否對(duì)AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，為臨床防治新生兒高氧性肺損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：將120只出生滿48小時(shí)的新生SD大鼠（雌雄不限）隨機(jī)分為三組：
　　I組：空氣對(duì)照組；
　　II組：高氧組（高氧+生理鹽水）；
　　III組：沐舒坦組（高氧+沐舒坦）。
　　I組新生大鼠置于常壓空氣中飼養(yǎng)。II組、III組新生大鼠置于氧濃度維持在9

3、5%以上的氧箱中飼養(yǎng)。III組于實(shí)驗(yàn)第一天起每日早晚腹腔注射沐舒坦(75mg/kg)各一次。Ⅰ組與II組于實(shí)驗(yàn)第一天起每日早晚腹腔注射等量生理鹽水各一次。
　　每組按實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為1天、3天、7天三個(gè)亞組，每組于各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)鼠十二只，處死取材檢測以下指標(biāo)：
　?。?）肺泡灌洗液中總蛋白含量；
　?。?）取左肺稱取其濕、干重，計(jì)算肺濕/干重比；
　　（3）肺組織病理學(xué)觀察：取右上肺行病理切片后觀察肺組

4、織病理改變；
　?。?）肺組織AQP1，Na+-K+-ATPaseα1，NKCC1蛋白及mRNA含量測定：取部分肺組織勻漿提取蛋白通過western blotting方法分別測定其蛋白含量；另取部分肺組織提取RNA，通過RT-PCR方法分別測定其mRNA含量。
　　結(jié)果：
　　1.各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況觀察：空氣組中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)好，飲食佳，生長發(fā)育正常，無死亡。高氧組中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高氧暴露1天時(shí)反應(yīng)好，膚色紅潤，離氧后無

5、呼吸困難表現(xiàn)出現(xiàn)。高氧暴露三天后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)尚可，脫離氧氣后呼吸頻率稍加快。高氧暴露七天時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神萎靡，少吃少動(dòng)，離氧后出現(xiàn)呼吸急促，唇色發(fā)紺，個(gè)別死亡。沐舒坦干預(yù)組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況較高氧組有改善，無實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。
　　2.肺組織病理學(xué)改變：空氣組大鼠各時(shí)相肺組織未見病理改變，肺泡大小均一、肺泡腔內(nèi)無液體滲出及細(xì)胞浸潤。高氧組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于高氧暴露1天時(shí)，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡內(nèi)可見少許紅細(xì)胞，無明顯滲出；3天后可見血管充血、肺間質(zhì)

6、水腫，肺泡內(nèi)紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤；7天時(shí)則出現(xiàn)肺組織水腫，結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡內(nèi)出血、液體滲出、炎癥細(xì)胞浸潤明顯加重。沐舒坦組的肺組織病理改變，肺泡腔內(nèi)液體滲出，紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤較高氧組明顯減輕。
　　3.肺組織濕/干重比（W/D）：實(shí)驗(yàn)1天時(shí)，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺組織W/D無明顯差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)3天、7天時(shí)，高氧組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺組織W/D較空氣對(duì)照組有升高，沐舒坦組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺組織W/D較高氧組有降低（P＜0.01）。

7、　　4.支氣管肺泡灌洗液（BLAF）中總蛋白（TP）含量測定：實(shí)驗(yàn)1天時(shí)，三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BLAF中TP含量差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而實(shí)驗(yàn)3天及7天時(shí)，高氧組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的BLAF中TP含量明顯高于空氣對(duì)照組(P＜0.01)，而沐舒坦組的BLAF中TP含量則明顯低于高氧組(P＜0.01)。
　　5.肺組織中AQP1，Na+-K+-ATPaseα1，NKCC1蛋白表達(dá)水平的變化：
　?。?）各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織中的AQ

8、P1的蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)第1天無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)第3天及第7天時(shí)，高氧組AQP1的蛋白表達(dá)水平較空氣組有明顯下降（P＜0.01）。沐舒坦干預(yù)組肺組織中的AQP1的蛋白表達(dá)明顯高于高氧組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　?。?）高氧組的Na+-K+-ATPaseα1的蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)第1天即低于空氣對(duì)照組（P＜0.05），且于實(shí)驗(yàn)第3天、7天下降更明顯（P＜0.01）。而沐舒坦組的Na+-K+-ATPaseα

9、1蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)第3天、7天較高氧組有升高（P＜0.05）。
　?。?）三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織中的NKCC1的蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)第1天時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)3天時(shí)，高氧組的NKCC1蛋白表達(dá)水平較空氣組有降低，而沐舒坦干預(yù)組的NKCC1蛋白表達(dá)水平則較高氧組有升高（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)第7天時(shí)，高氧組中的 NKCC1蛋白表達(dá)水平明顯低于空氣對(duì)照組，沐舒坦組的NKCC1蛋白表達(dá)水平明顯高于高氧組（P＜0.01）。

10、>　　6.肺組織中AQP1，Na+-K+-ATPaseα1，NKCC1的mRNA表達(dá)水平的變化：在本實(shí)驗(yàn)中，通過RT-PCR方法檢測顯示：
　　（1）高氧組肺組織中的AQP1的mRNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)第1天高于空氣組，而在實(shí)驗(yàn)第3天、7天時(shí)其AQP1的mRNA表達(dá)水平明顯低于空氣對(duì)照組（P＜0.01）。沐舒坦干預(yù)組的AQP1的mRNA表達(dá)水平則于實(shí)驗(yàn)第3天、7天高于高氧組（P＜0.05）。
　　（2）空氣組與高氧組肺組織中的N

11、a+-K+-ATPaseα1和NKCC1的mRNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)第1天及第3天均無顯著差異（P＞0.05），在實(shí)驗(yàn)第7天，高氧組的肺組織中Na+-K+-ATPaseα1及NKCC1的mRNA表達(dá)水平較空氣對(duì)照組的相應(yīng)mRNA表達(dá)有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而沐舒坦干預(yù)后，Na+-K+-ATPaseα1及NKCC1的mRNA表達(dá)水平與高氧組比較在各時(shí)間點(diǎn)均無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．暴露于高

12、濃度氧氣中一定時(shí)間可導(dǎo)致新生大鼠發(fā)生急性肺損傷，病理表現(xiàn)為肺組織水腫，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡內(nèi)出血、炎癥細(xì)胞浸潤明顯。
　　2.急性高氧性肺損傷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織中的AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的蛋白表達(dá)水平及AQP1的mRNA的表達(dá)水平較正?？諝饨M的肺組織的相應(yīng)蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯下降，且與肺水腫的程度相一致，提示AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的蛋白表達(dá)水平及AQP1的mRNA的