ZIC1基因在結(jié)腸癌中的表觀調(diào)控及其抑癌作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展涉及癌基因活化和抑癌基因失活。越來(lái)越多的證據(jù)表明表觀遺傳學(xué)改變與抑癌基因失活密切相關(guān)。表觀遺傳學(xué)改變主要包括DNA甲基化、組蛋白乙?；腿旧|(zhì)重塑等,其中DNA高甲基化是抑癌基因失活的最重要機(jī)制之一。對(duì)表觀遺傳學(xué)的研究不但可以揭示結(jié)腸癌新的發(fā)病機(jī)制,并且還有助于疾病的早期臨床診斷和預(yù)后判斷。
　　 ZIC1是我們前期通過(guò)cDNA芯片技術(shù)篩選到的,具有胃癌抑制作用的重要基因,并且發(fā)現(xiàn)一

2、系列結(jié)腸癌細(xì)胞中ZIC1沉默表達(dá)或表達(dá)明顯下調(diào),這種低表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化密切相關(guān)。ZIC1編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子,與脊椎動(dòng)物發(fā)育密切相關(guān),尤與腦組織和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ZIC1還參與腫瘤的發(fā)生,如ZIC1與髓母細(xì)胞瘤、纖維瘤、脂肪肉瘤和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 本課題中,我們通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌組織和癌旁組織中ZIC1 mRNA的差異表達(dá),并檢測(cè)ZIC1啟動(dòng)子甲基化情況,以期探討ZIC1在結(jié)腸癌中表達(dá)調(diào)控的可能機(jī)

3、制及基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌臨床診斷的潛在價(jià)值;同時(shí)通過(guò)外源性過(guò)表達(dá)ZIC1,明確其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制;最后采用表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選ZIC1基因調(diào)控的下游關(guān)鍵基因并進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。
　　 方法和材料:
　　 1.使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)24例結(jié)腸癌及相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中ZIC1基因mRNA表達(dá)水平;用甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)40例結(jié)腸癌及癌旁相對(duì)正常

4、組織的ZIC1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化情況。
　　 2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZIC1和篩選后,采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)(MTS)觀察過(guò)表達(dá)ZIC1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT29增殖的影響,采用流式細(xì)胞儀分析ZIC1對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　 3.利用Western blot檢測(cè)ZIC1對(duì)增殖PI3K,MEK/Erk通路蛋白(Akt,Erk1/2)和凋亡調(diào)控通路關(guān)鍵蛋白(Bad,Bcl-xl,Caspase-3)表達(dá)

5、的影響。
　　 4.HCT116細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-ZIC1和pCDNA3.1空白載體后,利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)人類(lèi)腫瘤發(fā)生相關(guān)的多功能基因的變化情況,對(duì)其中10個(gè)候選靶基因分別在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZIC1的HCT116和HT29細(xì)胞中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:
　　 1.qRT-PCR結(jié)果顯示:結(jié)腸癌組織中ZIC1 mRNA表達(dá)水平較癌旁相對(duì)正常組織明顯下調(diào)(Wilcoxon配對(duì)檢驗(yàn),p=0.0

6、001)。MSP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織發(fā)生ZIC1啟動(dòng)子高頻率甲基化(85％,34/40),而癌旁相對(duì)正常組織沒(méi)有發(fā)生甲基化。
　　 2.過(guò)表達(dá)ZIC1后結(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT116和HT29)克隆形成數(shù)較空載體對(duì)照組明顯減少(p＜0.01)。MTS增殖檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ZIC1后結(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT116和HT29)的存活細(xì)胞數(shù)較空載體對(duì)照組明顯減少(p＜0.01)。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ZIC1后,HCT116和H

7、T29細(xì)胞的凋亡水平較空載體組顯著增加(p＜0.05),而細(xì)胞周期無(wú)明顯改變(p＞0.05)。轉(zhuǎn)染ZIC1后結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116和HT29)增殖通路相關(guān)活性蛋白p-Akt,p-Erk1/2表達(dá)水平明顯下調(diào);凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)蛋白Bad和活化片段Caspase3(cleaved-Caspase3)表達(dá)水平明顯上調(diào),而抗凋亡蛋白p-Bad和Bcl-xl表達(dá)水平下調(diào)。
　　 4.通過(guò)mircoarray技術(shù)篩選ZIC1可能的下游調(diào)控基因

8、,分析得到337個(gè)下調(diào)基因,95個(gè)上調(diào)基因?；蚬δ軞w類(lèi)分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)的基因主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要細(xì)胞活動(dòng)。并對(duì)其中10個(gè)重要的靶基因(CCNA2,IGFBP3,ANGPT2,GADD45B,LAMB2,LAMB3,MALAT1,PNMA2,RPA4和TACSTD2),分別在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCT116和HT29細(xì)胞中進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證,其結(jié)果與基因表達(dá)譜芯片分析吻合。
　　 結(jié)論