小米米糠活性蛋白的制備及其抗結(jié)腸癌效應(yīng)研究.pdf

1、惡性腫瘤是威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一，全世界每年被診斷為癌癥的病人有1100萬(wàn)之多，預(yù)計(jì)到2020年每年新增病例將達(dá)到1600萬(wàn)。結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命，其死亡率僅次于肺癌和肝癌，占我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第三位。目前對(duì)于結(jié)腸癌的治療方法主要有手術(shù)療法、化學(xué)及放射療法?；瘜W(xué)療法和放射療法對(duì)機(jī)體有較大的毒副作用，如：減弱機(jī)體的免疫力，病人在治療后易感染等；雖然手術(shù)療法對(duì)機(jī)體傷害較小，但治愈率

2、低。因此，尋找高效無(wú)毒的抗腫瘤藥物一直是腫瘤學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。目前從天然產(chǎn)物中已經(jīng)獲得許多具有抗腫瘤活性的蛋白，如：植物凝集素蛋白，核糖體失活蛋白等，研究表明，這些活性蛋白具有高效、低毒的抗腫瘤效應(yīng)，因此是一類(lèi)極具發(fā)展前景的腫瘤治療藥物。
　　谷子（Setaria italica）屬一年生禾本科屬植物，起源于我國(guó)的黃河流域。米糠是谷子加工成小米的過(guò)程中得到的副產(chǎn)品。研究表明：米糠富含豐富的營(yíng)養(yǎng)組分和有益于健康的功能分子，如：甘油三酯

3、、脂蛋白、谷維醇、維生素B、維生素E、葡萄糖、纖維素以及微量元素等。有報(bào)道揭示米糠蛋白提取液具有抗氧化、抗真菌和抗高血糖等免疫調(diào)節(jié)功效。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于米糠抗腫瘤活性蛋白的研究尚屬空白。
　　本研究以純天然小米米糠為原料，利用生物化學(xué)技術(shù)從米糠蛋白粗提液中獲得了單一的抗腫瘤活性蛋白組分，命名為：FMBP；通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)該蛋白的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定；在細(xì)胞水平和裸鼠成瘤模型中探討了FMBP蛋白的抗腸癌效應(yīng)。分別從氧化應(yīng)激

4、、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞遷移等方面對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　?。?）采用丙酮沉淀和硫酸銨沉淀法制備米糠粗蛋白，通過(guò)SP-陽(yáng)離子交換層析、蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性結(jié)合體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，純化得到單一的蛋白組分FMBP，熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該蛋白分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的耐熱性。經(jīng)過(guò) SDS-PAGE電泳和 MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜分析，確定該蛋白的分子量為35.1531133 kD；經(jīng)MALD

5、I-TOF/MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定和基因序列分析，確定FMBP為一種分泌型過(guò)氧化物酶，且具有較強(qiáng)的過(guò)氧化物酶活性。
　　（2）在細(xì)胞水平上采用MTT法，分析了FMBP對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1、SW480、HT29和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株FHC增殖的影響。結(jié)果表明：FMBP能夠抑制三種結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，且具有濃度和時(shí)間依賴性，而對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC無(wú)明顯作用；隨后發(fā)現(xiàn)FMBP通過(guò)下調(diào)c-Myc，cyclinD1和p-R

6、b的表達(dá)水平來(lái)誘導(dǎo)結(jié)腸癌DLD1的細(xì)胞周期在G0/G1期阻滯，導(dǎo)致其增殖抑制；分別采用Hochest染色法和Annexin V/碘化丙啶雙染法檢測(cè)FMBP處理對(duì)DLD1和FHC細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)MBP處理后，DLD1的細(xì)胞核出現(xiàn)典型的凋亡小體，且當(dāng)FMBP的濃度為0.1 mg/ml時(shí)，DLD1細(xì)胞的凋亡率達(dá)到56.5％，而FHC細(xì)胞僅為9.5%。這些結(jié)果表明，F(xiàn)MBP能夠靶向誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。
　　（3）采用DCFH-

7、DA熒光探針標(biāo)記法，檢測(cè)FMBP處理對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1、HCT116和正常細(xì)胞FHC內(nèi)ROS水平的變化。結(jié)果表明，F(xiàn)MBP處理后，DLD1、HCT116和FHC細(xì)胞內(nèi)ROS含量均升高。當(dāng)FMBP的濃度為0.1 mg/ml時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1和HCT116內(nèi)的ROS含量分別升高了10倍和6倍，而FHC細(xì)胞的增加幅度較小，僅升高了2倍。隨后檢測(cè)了 FMBP處理對(duì)三種細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：結(jié)腸癌DLD1和HCT116細(xì)胞的CAT

8、活性和GSH含量均下降，而FHC細(xì)胞無(wú)明顯變化；用ROS抑制劑NAC和FMBP共處理以上三種細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FMBP誘導(dǎo)的以上效應(yīng)均被顯著逆轉(zhuǎn)。
　　（4）通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位和caspases家族蛋白的表達(dá)量，進(jìn)一步確定了FMBP誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，經(jīng)FMBP處理后，DLD1細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降；Western blotting結(jié)果顯示，caspase-8，caspase-9和caspase-3被顯著激活，促凋亡蛋

9、白Bax表達(dá)量上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降。加入廣譜caspase抑制劑z-VAD-FAK后，這種效應(yīng)被顯著逆轉(zhuǎn)，表明FMBP可通過(guò)caspase依賴的信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　?。?）采用細(xì)胞劃痕法檢測(cè)了FMBP對(duì)DLD1和FHC細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明：FMBP能夠顯著抑制結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞的遷移，而對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC無(wú)影響。進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)MBP對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的抑制效應(yīng)是通過(guò)抑制DLD1細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（

10、EMT）實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果提示：FMBP處理首先抑制JAK1/STAT3信號(hào)通路，導(dǎo)致STAT3下游靶基因c-Myc和Snail-1蛋白表達(dá)水平下降，EMT途徑受阻。為了驗(yàn)證STAT3的關(guān)鍵作用，本研究構(gòu)建了慢病毒重組質(zhì)粒pLVXAcGFP1-N1-STAT3，建立了過(guò)表達(dá)STAT3的DLD1穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)STAT3過(guò)表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)FMBP誘導(dǎo)的抗遷移效應(yīng)。
　?。?）用結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞建立了裸鼠皮下成瘤模型。通過(guò)腹腔注射的方法，

11、定期進(jìn)行給藥處理（共6次）。結(jié)果顯示，F(xiàn)MBP蛋白在裸鼠體內(nèi)能夠顯著抑制結(jié)腸癌腫瘤的生長(zhǎng)，而不影響裸鼠的正常生長(zhǎng)。隨后采用免疫組化的方法對(duì)腫瘤組織中與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，包括：Ki-67、caspase-8， caspase-3，TUNEL、STAT3、p-STAT3、E-cadherin、Vimentin，其結(jié)果與細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
　　綜上所述：FMBP是一種分泌型的過(guò)氧化物酶，該蛋白在細(xì)胞水平和裸