嘧啶類姜黃素類似物抗結(jié)腸癌活性及機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是死亡率最高的癌癥之一,并且,近年來(lái)伴隨著飲食習(xí)慣和生活方式的變化,其發(fā)病率呈增高趨勢(shì)。因此,關(guān)于結(jié)腸癌的研究得到越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注。姜黃素是一種從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取得到的一種化學(xué)成分,在人們的日常生活中,發(fā)現(xiàn)其對(duì)治療癌癥有一定的效果,研究也表明姜黃素能夠通過(guò)多種機(jī)制抑制癌癥的發(fā)展。但姜黃素也有水溶性和穩(wěn)定性差,利用率低等缺點(diǎn),于是,我們?cè)O(shè)計(jì)合成了六個(gè)嘧啶類姜黃素類似物,以期能彌補(bǔ)姜黃素的缺點(diǎn)。在本論文中我們

2、對(duì)這些化合物抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,希望能進(jìn)一步確定這類化合物的藥效官能團(tuán)為以后的藥物設(shè)計(jì)提供支持。
　　同時(shí),我們還研究了這些化合物對(duì)細(xì)胞表面糖胺聚糖含量的影響。糖胺聚糖作為一種重要的生物大分子,能夠通過(guò)與多種生長(zhǎng)因子結(jié)合,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸入、血管生成和轉(zhuǎn)移都能起到重要調(diào)控作用。因此,我們通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)糖胺聚糖的提取、結(jié)構(gòu)分析和活性分析確定經(jīng)藥物處理后細(xì)胞表面的糖胺聚糖發(fā)生了怎樣的變化。通過(guò)分析我們想進(jìn)一步闡

3、釋糖胺聚糖與癌癥的關(guān)系,并且通過(guò)分析這些糖胺聚糖的活性更直觀的確定糖胺聚糖引起的那些生物變化是對(duì)抑癌作用有利的。
　　1.羥基取代嘧啶類姜黃素類似物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的顯著抑制作用
　　根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)我們將這六個(gè)化合物分為三組,每組中兩個(gè)化合物的區(qū)別僅僅是其中一個(gè)化合物的羥基取代了另一個(gè)化合物的末端氫。通過(guò)熒光法檢測(cè)這些化合物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制,我們發(fā)現(xiàn)在三組化合物內(nèi)有類似的結(jié)果,帶羥基的4b,4d和4f的抑癌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于對(duì)應(yīng)的烷基

4、取代物,這就啟示我們末端羥基是這類化合物發(fā)揮抑癌效果所必需的。
　　2.4b對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有明顯的周期阻滯作用
　　通過(guò)在兩株腸癌細(xì)胞系上檢測(cè)4a和4b對(duì)細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)4b有明顯的G2/M期阻滯作用,并且4b能促進(jìn)p21蛋白表達(dá)的增加,同時(shí)還能顯著降低細(xì)胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶的表達(dá)。而相同濃度的4a卻沒(méi)有明顯的細(xì)胞周期阻滯作用。
　　3.4b能顯著增加促凋亡蛋白的表達(dá)
　　通過(guò)用Werstern檢測(cè)

5、4a和4b對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)4b能通過(guò)多種途徑激活凋亡信號(hào)通路。首先,4b能顯著降低上游信號(hào)蛋白EGFR和p-EGFRR的表達(dá),其次,4b還能增加caspase3和凋亡受體PARP的表達(dá)。同時(shí),4b還能影響B(tài)cl-2蛋白家族的表達(dá),例如明顯的降低Bcl-2蛋白的表達(dá),同時(shí)增加Bax蛋白的表達(dá)。最后,4b也能降低熱休克單邊HSP-90和HSP-70蛋白的表達(dá)。這些都說(shuō)明,4b能顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,而同空白組相比

6、4b的作用卻不明顯。
　　4.4b使得細(xì)胞表面的糖胺聚糖的含量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變
　　我們對(duì)不同組細(xì)胞內(nèi)的糖胺聚糖進(jìn)行了提取并且用硫酸-咔唑法測(cè)定了每樣品中糖醛酸的含量,用液相色譜檢測(cè)了樣品糖胺聚糖中葡萄糖胺和半乳糖胺含量的變化。通過(guò)這些檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)4b(10μM)能顯著增加糖醛酸和葡萄糖胺以及半乳糖胺的含量,4a在相同濃度之下雖然也能增加它們的表達(dá),但增加量是有限的。不過(guò)同空白組相比,經(jīng)4a和4b處理后,葡萄糖胺同半乳糖胺的

7、比例均下降。
　　5.4a和4b對(duì)糖胺聚糖生物活性的影響
　　BaF3是一株生長(zhǎng)因子依賴性細(xì)胞,在其體內(nèi)不能表達(dá)內(nèi)源性的生長(zhǎng)因子,只有同時(shí)補(bǔ)加外源性的生長(zhǎng)因子和糖胺聚糖時(shí)細(xì)胞才能正常生長(zhǎng)。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),從4b處理后的細(xì)胞內(nèi)提取的糖胺聚糖能更好的促進(jìn)BaF3細(xì)胞的生長(zhǎng),并且其對(duì)FGF1的影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于FGF8,這表明該組樣品內(nèi)的糖胺聚糖能更好的與FGF1以及FGFR1形成三原復(fù)合物從而促進(jìn)BaF3細(xì)胞的生長(zhǎng)。而4a組內(nèi)的糖胺聚

8、糖卻不能促BaF3細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí),通過(guò)用流式細(xì)胞儀直接檢測(cè)這些生長(zhǎng)因子同細(xì)胞表面的糖胺聚糖的結(jié)合能力可以更直觀的發(fā)現(xiàn),經(jīng)4b處理后糖胺聚糖同生長(zhǎng)因子的結(jié)合能力明顯增強(qiáng),而經(jīng)4a處理后卻不能達(dá)到相同的效果,這表明經(jīng)藥物處理后,兩組細(xì)胞表面的糖胺聚糖發(fā)生了不同的變化。而且可以發(fā)現(xiàn)同樣經(jīng)4b(10μM)處理后,雖然與FGF8的結(jié)合也向高能量方向移動(dòng),但其數(shù)值仍然較低,這同對(duì)BaF3的促增長(zhǎng)作用的結(jié)果是一致的,都表明4b更多的是通過(guò)FGF1信