轉(zhuǎn)染IL-21結(jié)腸癌細(xì)胞瘤苗的制備及其抗腫瘤效應(yīng)的初步研究.pdf

1、目的：IL-21是新近發(fā)現(xiàn)的Ⅰ類細(xì)胞因子。它可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力來對(duì)某些腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。目前已成為腫瘤基因治療中一個(gè)新的候選目的基因。把IL-21基因轉(zhuǎn)染到鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中構(gòu)建重組細(xì)胞，將該細(xì)胞注射給裸鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞生長緩慢，提示IL-21可以影響腫瘤細(xì)胞的生長。因此本研究擬用同位素Co60照射方法給予已成功轉(zhuǎn)染IL-21的Colon26細(xì)胞致死劑量的照射使其失去致瘤性，制備成仍保留有抗腫瘤活性的轉(zhuǎn)基因瘤苗。通過與未照射親

2、株細(xì)胞的對(duì)比，觀察其生物學(xué)性狀及抗腫瘤效應(yīng)的差異。以期為今后結(jié)腸癌的基因治療提供理論依據(jù)。 方法：將Colon26/IL-21細(xì)胞給予50GyCo60同位素照射后制備成瘤苗；在光鏡下觀察照射前后Colon26/IL-21細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法測定出經(jīng)50GyCo60照射后Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗的生長情況并比較照射前后此細(xì)胞株的生長活力和細(xì)胞增殖的變化，并且在照射后的不同時(shí)間點(diǎn)采用RT-PCR的方法

3、檢測IL-21基因的轉(zhuǎn)錄情況、比較其在不同的時(shí)間點(diǎn)量的變化；采用流式細(xì)胞分析方法檢測經(jīng)50GyCo60照射后Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗的凋亡率、細(xì)胞周期改變、增殖活力情況；采用ELISA法測定Colon26/IL-21細(xì)胞、經(jīng)50GyCo60照射后Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗、經(jīng)50GyCo60照射后Colon26細(xì)胞與BALB/c小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)其上清液中分泌的IFN-γ水平變化；將制備好的Colon26/IL-21細(xì)胞

4、瘤苗接種到同源基因BALB/c近交系小鼠腳墊連續(xù)觀察其致瘤性及抑制同源基因鼠結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤生長的作用。 結(jié)果：1通過用同位素Co60照射方法給予50Gy劑量于Colon26/IL-21細(xì)胞，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT方法證明瘤苗的生長和增殖活力受到抑制，Colon26/IL-21細(xì)胞其倍增時(shí)間大約是2.1天，而照射后的Colon26/IL-21細(xì)胞經(jīng)過4天培養(yǎng)后其細(xì)胞數(shù)目減少了一半，此瘤苗在5天后只有大約50％的細(xì)胞保持代謝活力，7天

5、后只有大約30％細(xì)胞保持代謝活力；通過流式細(xì)胞技術(shù)方法測定實(shí)驗(yàn)組(照射后的Colon26/IL-21細(xì)胞培養(yǎng)第4天)和對(duì)照組(Colon26/IL-21細(xì)胞)凋亡率、增殖指數(shù)、細(xì)胞周期分布，實(shí)驗(yàn)組凋亡率、增殖指數(shù)為35.547±3.787％、20.579±4.860％較對(duì)照組0.734±0.115％、45.843±0.721％相比均有明顯顯著性差異(P＜0.01)，照射后實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞產(chǎn)生明顯的G1期阻滯(G1期細(xì)胞百分比為79.421±

6、4.860％)，與對(duì)照組相比(G1期細(xì)胞百分比為54.157±0.721％)，有顯著性差異(P＜0.01)而實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞(S期細(xì)胞百分比為12.936±3.238％)與對(duì)照組(S期細(xì)胞百分比為31.271±0.757％)相比顯著減少、并且有顯著性差異(P＜0.01)；通過RT-PCR的方法檢測Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗IL-21基因在第1、3、5天時(shí)仍然還有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并且其量呈遞減趨勢；通過此三方面的證據(jù)可以說明照射后的Colo

7、n26/IL-21細(xì)胞增殖受到抑制，50％的細(xì)胞在4天后仍然有代謝活性，其目的基因IL-21仍然有轉(zhuǎn)錄。接種1×106個(gè)照射后的Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)組小鼠腳墊，7天后觀察局部無腫瘤細(xì)胞生長的跡象、連續(xù)觀察45天局部未見腫瘤細(xì)胞生長。 2制備成Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗后將瘤苗的抗腫瘤具體效應(yīng)分為體內(nèi)、體外兩方面：(1)不同刺激原作用下，小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)其上清液中IFN-γ平均含量。實(shí)驗(yàn)中證明Col

8、on26/IL-21細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)其上清液中IFN-γ平均含量為23.767±3.123pg/ml，照射后的Colon26/IL-21細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)其上清液中IFN-γ平均含量為21.930±2.386pg/ml，兩者比較無明顯顯著性差異(P＞0.05)。照射后的Colon26細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)其上清液中IFN-γ平均含量為10.900±1.224pg/ml，與前兩者比較有明顯顯著性差異(P＜0.01)；(2)體內(nèi)動(dòng)

9、物實(shí)驗(yàn)中證明：接種5×103個(gè)Colon26細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腳墊，自接種后的第3天開始每隔4天繼續(xù)向?qū)嶒?yàn)組小鼠背部接種1×105個(gè)照射后的Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗1次，共追加5次。連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腳墊局部成瘤效果。結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠腳墊在接種5×103個(gè)Colon26細(xì)胞后的第7天局部腫瘤細(xì)胞開始生長，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在第7天局部也同時(shí)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞生長跡象，第26天觀察小鼠局部腫瘤細(xì)胞生長狀況發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠局部腫

10、瘤平均體積為8.270±1.372cm3而實(shí)驗(yàn)組小鼠局部腫瘤平均體積為7.963±1.115cm3，兩者比較無顯著性差異(P＞0.05)。接種5×103個(gè)Colon26細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腳墊，自接種后的第3天開始每隔4天繼續(xù)向?qū)嶒?yàn)組小鼠背部接種2×106個(gè)照射后的Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗1次，共追加5次。連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腳墊局部成瘤效果。結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠腳墊在接種5×103個(gè)Colon26細(xì)胞后的第7天局部腫

11、瘤細(xì)胞開始生長，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在第7天局部也同時(shí)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞生長，第26天觀察小鼠局部腫瘤生長狀況發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠局部腫瘤平均體積為8.032±1.595cm3而實(shí)驗(yàn)組小鼠局部腫瘤平均體積為1.887±0.529cm3，兩者比較有顯著性差異(P＜0.01)具體計(jì)算其抑瘤率為76.51％。 結(jié)論：1經(jīng)過50GyCo60照射Colon26/IL-21細(xì)胞后，與其親代細(xì)胞相比增殖指數(shù)下降、凋亡率上升，出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯。在照射后體外培

12、養(yǎng)的過程中其目的基因IL-21仍然有轉(zhuǎn)錄，但是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量呈遞減趨勢，表明在照射后其內(nèi)部基因的轉(zhuǎn)錄會(huì)隨著細(xì)胞周期的改變、凋亡率的上升而逐漸減少。2連續(xù)觀察制備的Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗在體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中不具有致瘤性。3體外實(shí)驗(yàn)證明照射后的Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗可以在體外刺激BALB/c小鼠脾細(xì)胞，其產(chǎn)生IFN-γ的量較未照射的Colon26/IL-21細(xì)胞沒有明顯差別。4皮下接種Colon26/IL-21細(xì)胞瘤苗可以