經(jīng)典Wnt-β-catenin信號(hào)通路在椎間盤(pán)退變中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究由如下四部分構(gòu)成：
　　 一、β--catenin 在人退變椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá)及意義β--catenin 在人退變椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá)及意義
　　 目的：檢測(cè)β連環(huán)蛋白（β-catenin）在人退變椎間盤(pán)髓核和正常髓核組織中表達(dá)差異，初步探討經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路與椎間盤(pán)退變的關(guān)系。
　　 方法：收集2007年5月至2008年3月于我院手術(shù)的腰椎間盤(pán)突出癥患者髓核組織標(biāo)本28例（男17

2、例，女11例）作為試驗(yàn)組，平均年齡45歲（26～63歲）；收集同期因腰段脊柱創(chuàng)傷手術(shù)治療的患者髓核組織標(biāo)本12例（男9例，女3例）作為對(duì)照組，平均年齡35歲（18～55歲）。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和蛋白印跡法（western-blot）分別檢測(cè)退變組和創(chuàng)傷組椎間盤(pán)髓核組織β-catenin mRNA與蛋白的表達(dá)，比較其差異并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：β-catenin mRNA與蛋白表達(dá)在退變組中均明顯高于創(chuàng)傷組，熒

3、光定量RT-PCR 比值約為2.85：1；蛋白印跡各組平均光密度比值分別為0.76±0.04，0.13±0.02，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：β-catenin 在人退變椎間盤(pán)髓核組織中表達(dá)增高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可能在椎間盤(pán)退變過(guò)程中發(fā)揮了作用。
　　 二、TNF--α注射構(gòu)建兔椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型中β-catenin 蛋白的表達(dá)及意義
　　 目的：通過(guò)外源性TNF-α

4、注射構(gòu)建兔椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型，探討該模型中β-catenin 蛋白的表達(dá)及意義，以明確炎性細(xì)胞因子在促進(jìn)腰椎間盤(pán)退變過(guò)程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用。
　　 方法：選取12只健康成年日本白兔，雌雄隨機(jī)，體重2.5～3.0Kg。手術(shù)暴露L2～5 3個(gè)間隙共36個(gè)椎間盤(pán)。隨機(jī)分為4組，分別注入生理鹽水，TNF-α5ng，TNF-α10ng，TNF-α20ng，于術(shù)后第8 周統(tǒng)一處死，取椎間盤(pán)髓核組織作HE-番紅0 染色

5、病理切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；各組分別隨機(jī)選取4個(gè)椎間盤(pán)髓核組織標(biāo)本，采用蛋白印跡法（western-blot）測(cè)定β-catenin蛋白含量并比較各組間差異。
　　 結(jié)果：HE-番紅0 染色病理切片顯示，在5ng、10ng、20ng組椎間盤(pán)組織中髓核細(xì)胞數(shù)量減少，正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)肥大空泡樣軟骨細(xì)胞，組織基質(zhì)蛋白聚糖含量明顯降低，番紅0 淡染，表明兔椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型構(gòu)建成功，退變程度與TNF-α濃度相關(guān)。生理

6、鹽水對(duì)照組椎間盤(pán)形態(tài)基本正常，無(wú)退變發(fā)生。蛋白印跡結(jié)果顯示β-catenin 蛋白含量在注射TNF-α組明顯增加，各組光密度比值分別為：0.142±0.036、0.351±0.041、0.472±0.052和 0.710±0.063，組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）且與TNF-α濃度相關(guān)。
　　 結(jié)論：通過(guò)外源性TNF-α盤(pán)內(nèi)注射能夠成功構(gòu)建兔椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型，且退變程度與TNF-α呈濃度依賴(lài)性；在退變模型髓核組織中β

7、-catenin蛋白含量增高且與TNF-α濃度相關(guān)，提示炎癥細(xì)胞因子觸發(fā)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。
　　 三、綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組DKK-1 腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的DKK1腺病毒表達(dá)載體，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，分離、純化并大量擴(kuò)增.
　　 方法：構(gòu)建含配對(duì)序列、酶切位點(diǎn)

8、和DKK-1基因序列的PCR 引物，使用PCR技術(shù)從DKK1 質(zhì)粒中提取DKK1基因序列，與pDC315-eGFP 真核表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切并純化酶切產(chǎn)物，在感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞反應(yīng)體系中構(gòu)建真核表達(dá)載體，提取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR 產(chǎn)物鑒定，同AdMax 腺病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞重組并包裝出腺病毒載體，培養(yǎng)HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，按Adeno-X Virus Purification Kit (BD Bioscience

9、s,Clontech)步驟純化重組腺病毒。使用腺病毒轉(zhuǎn)染正常HEK293細(xì)胞，24 小時(shí)后觀察GFP熒光表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：PCR 證實(shí)重組腺病毒包含DKK-1基因，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后熒光顯微鏡下可見(jiàn)明亮的綠色熒光穩(wěn)定表達(dá)，蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可表達(dá)GFP。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組DKK-1 腺病毒表達(dá)載體，能感染HEK293細(xì)胞并表達(dá)目的基因，通過(guò)GFP標(biāo)記可連續(xù)而直接地觀察細(xì)胞中的基因表達(dá)。

10、>　　 四、DKK1 腺病毒阻斷Wnt信號(hào)通路對(duì)體外培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞基質(zhì)的保護(hù)作用
　　 目的：探討Wnt 通路在髓核細(xì)胞退變中的生物學(xué)機(jī)制及DKK1 腺病毒阻斷Wnt信號(hào)通路對(duì)體外培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞基質(zhì)的保護(hù)作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)兔椎間盤(pán)髓核細(xì)胞，取培養(yǎng)第二代細(xì)胞隨機(jī)分為4組加藥，A組：空白對(duì)照組，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組：加入TNF-α20ng/ml作為退變組；C組：加入MOI 為200的Adv-eGFP 腺病毒液，T

11、NF-α20ng/ml作為熒光對(duì)照組；D組：加入MOI 為200的Adv-hDKK1 腺病毒液，TNF-α20ng/ml作為實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染換液后繼續(xù)培養(yǎng)一周,PT-PCR法檢測(cè)不同組β-catenin、II型膠原和MMP-13 mRNA的表達(dá)；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)II型膠原表達(dá)；番紅O 染色檢測(cè)蛋白聚糖的表達(dá)變化，熒光顯微鏡鏡下觀察各組eGFP表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：倒置相差顯微鏡發(fā)現(xiàn)B組和C組髓核細(xì)胞數(shù)量減少，正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，

12、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂；A組和D細(xì)胞形態(tài)基本正常，部分細(xì)胞互相粘附。PT-PCR法檢測(cè)不同組β-catenin、II型膠原和MMP-13 mRNA發(fā)現(xiàn):β-catenin mRNA 在A組基本不表達(dá)，B組和C組明顯表達(dá)，D組僅少許表達(dá),與內(nèi)參比值分別為B組0.677，C組0.632，D組0.121；II型膠原mRNA 在A組和D組表達(dá)明顯高于B組和C組，與內(nèi)參比值分別為A組0.652，B組0.159，C組0.214，D組0.638；M

13、MP-13 mRNA 在B組和C組表達(dá)明顯高于A組和D組,與內(nèi)參光密度比值分別為A組0.184，B組0.627，C組0.632，D組0.154。II型膠原免疫組織化學(xué)染色顯示A和D組呈現(xiàn)陽(yáng)性，B組和C組為弱陽(yáng)性，僅有少數(shù)細(xì)胞染色，II型膠原蛋白表達(dá)明顯降低，番紅染色顯示蛋白聚糖含量在C和B組較A和D組明顯降低，胞外基本無(wú)紅染，僅少數(shù)細(xì)胞周?chē)?。熒光顯微鏡觀察顯示C和D組明顯熒光表達(dá)，A組和B組為陰性，表明Adv-hDKK-1 腺病毒成

14、功轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞且表達(dá)目的基因。
　　 結(jié)論：退變組和熒光對(duì)照組細(xì)胞發(fā)生退行性改變，β-catenin和MMP mRNA表達(dá)明顯增高，II型膠原mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，蛋白聚糖含量明顯降低。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)正常，β-catenin和MMP-13 mRNA 僅少許表達(dá)，II型膠原和蛋白聚糖表達(dá)正常。這表明200MOI的Adv-hDKK1 能成功轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞且表達(dá)目的基因，DKK1 在TNF誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞退變過(guò)程中阻斷了Wnt/β-