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文檔簡介
1、目的:探討應用EGF、bFGF誘導BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化的的可行性,并進一步研究Wnt/β-catenin信號通路在BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化中的作用。
方法:取4周齡大健康清潔級SD大鼠骨髓,采用全骨髓貼壁法體外培養(yǎng)BMSCs,流式細胞儀檢測P3代細胞表面的骨髓基質(zhì)標志CD90和造血細胞標志CD45。取P3代細胞,根據(jù)誘導條件不同分為4組:空白對照組(1%胎牛血清+DMEM/F-12)、EGF組(20ng/mlEGF+1
2、%胎牛血清+DMEM/F-12)、bFGF組(20ng/mlbFGF+1%胎牛血清+DMEM/F-12)、EGF+ bFGF組(20ng/mlEGF+20ng/mlbFGF+1%胎牛血清+DMEM/F-12),倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,誘導7天后,采用免疫細胞化學法和Western blot檢測神經(jīng)細胞標志蛋白NSE、GFAP的表達,RT-PCR檢測NSE、GFAP、nestin、β-catenin、BDNF、GDNF基因mRNA
3、的變化。
結果:P3代BMSCs大致呈單一的長梭形或扁平形,緊密漩渦樣排列生長,流式細胞儀示CD90表達高達98.95%,而CD45表達僅1.28%;誘導7天后bFGF和EGF+bFGF組細胞收縮變圓,向四周伸出多個明顯突起,部分突起間存在連接,表現(xiàn)出典型的神經(jīng)元樣細胞形態(tài),而EGF組、空白組變化不明顯;免疫細胞染色示EGF組GFAP陽性率高于NSE,而bFGF和EGF+bFGF組NSE陽性率高于GFAP; EGF+bFGF組
4、NSE、GFAP陽性率最高,bFGF組次之,與空白對照組、EGF組比較差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.0042)。Western blot檢測結果與免疫細胞染色結果一致。RT-PCR檢測NSE、GFAPmRNA改變類似于相應蛋白改變,但EGF+bFGF組GFAPmRNA表達量低于bFGF組,差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05);nestin在bFGF組、EGF+bFGF組較空白組及EGF組顯著增高,EGF組低于空白組,差異均有統(tǒng)計學意義(p<0
5、.05);β-catenin、BDNF在EGF組、bFGF組、EGF+bFGF組顯著高于空白組,各組間差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05); GDNF在bFGF組、EGF+bFGF組顯著高于其他組,且bFGF組高于EGF+bFGF組,差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
結論:bFGF、EGF可誘導BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化,分化過程中β-catenin、BDNF、GDNF基因表達增高,Wnt/β-catenin信號通路可能在B
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