Wnt-β-catenin信號通路在胚胎癌細胞增殖中的作用及其機制研究.pdf

1、目的及意義:睪丸生殖細胞瘤(testicular germ cell tumors,TGCT)是中青年男性中最常見的惡性腫瘤,近年來,其發(fā)病率呈上升趨勢。畸胎癌(Teratocarcinoma)是一種較常見的TGCT,好發(fā)于新生兒和嬰幼兒,其惡性程度隨年齡增長而增高?；グ┲谐蟹只娜邔觼碓吹慕M織外,還含有未分化的胚胎癌細胞(Embryonic carcinoma cells,EC)。分離EC細胞,重新進行小鼠皮下或腹腔注射,可產(chǎn)

2、生新的畸胎癌。這表明畸胎癌可來源于EC細胞。因此研究調(diào)控EC細胞增殖和分化的分子機制,對于了解畸胎癌的發(fā)生機制有重要意義。
　　 EC細胞是一類具有多分化潛能和自我復制能力的干細胞,可在體外無限增殖形成永生的細胞系,如小鼠的EC細胞系P19。在一定誘導條件下,EC細胞可分化為三胚層來源的各種細胞。EC細胞自我更新和分化的分子機制尚不完全清楚。
　　 Wnt／β—catenin信號通路是wnt信號轉導通路中的經(jīng)典通路,不僅

3、參與正常細胞和干細胞的增殖和分化,而且與腫瘤的發(fā)生密切相關。探討Wnt／β—catenin在EC增殖和分化中的作用和作用機制,不僅有助于闡明畸胎癌形成的分子調(diào)控機制,而且能為畸胎癌及相關生殖細胞腫瘤的基因靶向治療提供有效的實驗依據(jù)。目前,關于wnt／β—catenin信號通路在畸胎癌中作用及其機制的研究在國內(nèi)外少有文獻報道。
　　 本研究對小鼠畸胎癌細胞系P19細胞進行體外培養(yǎng),通過免疫熒光染色、BrdU標記、MTT比色、RT—

4、PCR及Western blotting等方法檢測胚胎癌干細胞標志性基因的表達及其變化規(guī)律。從而深入探討wnt／β—catenin信號通路在胚胎癌細胞增殖中的作用,并初步探討其可能的作用機制,為將來的基因診斷與基因治療提供有力的實驗與理論依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1.P19細胞體外傳代培養(yǎng)將細胞分為四組,分別為:正常對照組(Con組),添加SB216763組(SB組),添加全反式維甲酸(all trans—RA)組

5、(RA組)和添加SB216763與all trans—RA組(SB+RA組)。培養(yǎng)2d時,通過免疫熒光雙標染色,檢測Oct4／β—catenin基因在四組細胞中的表達及其變化規(guī)律。
　　 2.細胞培養(yǎng)3d時,通過BrdU標記,比較四組細胞間增殖情況；通過MTT比色,比較四組細胞間存活率的差異。
　　 3.細胞培養(yǎng)1d時,通過RT—PCR法檢測四組中Oct4、B—catenin等基因mRNA水平的表達及變化規(guī)律；通過Wes

6、tern blotting法,檢測四組中Oct4蛋白水平的表達及變化規(guī)律。
　　 4.細胞培養(yǎng)2d及7d時,通過免疫熒光染色、RT—PCR及Western blotting等方法檢測C—myc基因于四組中的表達及變化規(guī)律。
　　 結果:
　　 1.免疫熒光雙標染色結果顯示,Con和RA組β—catenin主要分布于胞質(zhì),核內(nèi)分布較少；SB組和SB+RA組β—catenin主要分布于細胞核。RA組Oct4表達較其它

7、三組均明顯減少。SB組和SB+RA組B—catenin入核的細胞數(shù)和核內(nèi)Oct4分布明顯多于對照組和RA組。
　　 2.BrdU標記結果顯示,RA組BrdU標記細胞較對照組少,SB組和SB+RA組BrdU標記細胞明顯多于對照組,差異有顯著意義(P<0.05)。MTT結果顯示,RA組OD值低于對照組,SB組和SB+RA組OD值明顯高于對照組,差異有顯著意義(P<0.05)；SB組和SB+RA組之間差異無顯著意義。
　　 3

8、.RT—PCR結果顯示,RA組Oct4 mRNA水平明顯低于對照組,SB組和SB+RA組Oct4 mRNA水平高于對照組；Sox2 mRNA水平在各組之間的差異類似于Oct4；Nanog和Stat3在四組之間差異不明顯；Western blotting結果顯示,RA組Oct4蛋白水平明顯低于對照組,SB組和SB+RA組Oct4蛋白水平高于對照組。
　　 4.培養(yǎng)2d和7d的免疫熒光染色結果顯示,SB組和SB+RA組C—myc核內(nèi)

9、表達明顯高于正常對照組和RA組。RT—PCR和Western blotting結果顯示,RA組C—myc基因表達低于對照組,SB組和SB+RA組C—myc基因表達高于對照組,SB組和SB+RA組兩組之間無明顯差異。
　　 結論:
　　 分析以上實驗結果,我們得出以下結論:
　　 1.wnt／β—catenin信號通路的激活促進P19細胞中Oct4的表達,抑制RA誘導的細胞分化。
　　 2.wnt／β—ca