氟中毒大鼠骨組織中Wnt-β-catenin信號(hào)通路的改變.pdf

1、前言:
　　 地方性氟中毒(endemicfluorosis)簡(jiǎn)稱(chēng)地氟病,屬地球化學(xué)性疾病,是一種以氟斑牙(dentalfluorosis)和氟骨癥(skeletalfluorosis)為主要特征的全身慢性中毒性疾病。氟骨癥病理表現(xiàn)形式是以成骨細(xì)胞功能活躍以及與此密切相關(guān)的骨轉(zhuǎn)換加速為其主要特征。研究表明,氟能夠通過(guò)刺激成骨細(xì)胞成骨而使骨量增加、骨密度升高。氟中毒時(shí),成骨細(xì)胞細(xì)胞數(shù)增多、胞體肥大、DNA合成增加、各種骨形成標(biāo)志物

2、水平升高,呈明顯活躍狀態(tài)。
　　 Wnt信號(hào)通路是近年來(lái)骨代謝中的研究熱點(diǎn),Wnt/β-catenin信號(hào)通路組分基因敲除和轉(zhuǎn)基因鼠模型以及一些體外實(shí)驗(yàn)都表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)節(jié)骨代謝以及成骨細(xì)胞的分化增殖中扮演著重要角,促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,分化及成熟。
　　 目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的研究主要集中于骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松等疾病上,在地方性氟中毒中是否發(fā)揮作用,尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

3、鑒于地方性氟中毒的氟骨癥表現(xiàn)、氟對(duì)成骨細(xì)胞的作用以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在成骨細(xì)胞中發(fā)揮的作用,我們擬通過(guò)復(fù)制慢性氟中毒大鼠模型,觀察β-catenin在骨組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平,初步探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在氟骨癥中可能發(fā)揮的作用,為闡明地方性氟中毒的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　 選取購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心剛斷乳Wistar雄性

4、大鼠32只,體重50-80克,按體重隨機(jī)分成四組,每組八只,其中對(duì)照組飲用自來(lái)水(含F(xiàn)-0.118mg/L)、低氟組(含F(xiàn)-50mg/L的自來(lái)水)、中氟組(含F(xiàn)-100mg/L的自來(lái)水)、高氟組(含F(xiàn)-150mg/L的自來(lái)水)。各組大鼠用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料喂養(yǎng),自由飲水及進(jìn)食,實(shí)驗(yàn)周期為3個(gè)月。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、大鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況觀察
　　 整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi),觀察大鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況,每周稱(chēng)取大鼠體重并作記

5、錄同時(shí)觀察大鼠牙齒變化。
　　 2、血氟測(cè)定
　　 實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后,乙醚麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈采血,分離得到血清,采用痕量氟化物測(cè)定方法檢測(cè)血中氟離子濃度。
　　 3、骨氟測(cè)定
　　 大鼠取完血后處死,快速取其左側(cè)股骨,并取下股骨近端1/3,迅速剔除肌肉、骨膜等結(jié)締組織,剔凈后100℃烤箱內(nèi)烤干至恒重,研磨成粉狀,采用高溫燃燒水解氟電極法測(cè)骨氟含量。
　　 4、HE切片病理學(xué)觀察及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

6、r>　　 大鼠處死后,迅速剝離左側(cè)完整脛骨,固定脫鈣后常規(guī)石蠟包埋,冠狀位切片后制成石蠟切片。常規(guī)脫蠟水合,蘇木素伊紅染色后,進(jìn)行病理學(xué)觀察和形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)分析。
　　 5、提取骨組織RNA進(jìn)行目的基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)
　　 使用RNAiso試劑盒提取骨組織RNA,按照PrimeScript(R)RTreagentKit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,SYBR(R)PremixExTaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶

7、鏈?zhǔn)椒磻?yīng),通過(guò)數(shù)據(jù)分析目的基因mRNA表達(dá)水平。
　　 6、石蠟切片免疫組織化學(xué)染色
　　 石蠟切片常規(guī)脫蠟水合后以兔抗大鼠β-catenin多克隆抗體為一抗,以生物素化山羊抗兔IgG為二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,照相。
　　 三、統(tǒng)計(jì)分析方法
　　 采用SPSS11.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。
　　 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析方法進(jìn)行分析。

8、P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、大鼠一般生長(zhǎng)情況
　　 實(shí)驗(yàn)周期內(nèi),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠體重增加量相似,呈動(dòng)態(tài)變化。各組大鼠體重差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2、大鼠血氟和骨氟水平
　　 各實(shí)驗(yàn)組大鼠的血氟和骨氟水平較對(duì)照組都明顯升高(P<0.01),并且血氟和骨氟水平隨著染毒劑量的增高而升高。
　　 3、骨組織病理學(xué)觀察及形態(tài)計(jì)量學(xué)分析
　　

9、 低倍鏡下(10×)可見(jiàn),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠骨小梁增多,排列紊亂且相互連接成網(wǎng),并且隨染氟劑量的升高,上述骨小梁改變明顯。
　　 染氟三個(gè)月后,與對(duì)照組相比,150mg/LF-組大鼠骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(%Tb.Ar)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)明顯升高(P<0.05),50mg/LF-組以及100mg/LF-組大鼠骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(%Tb.Ar)雖增高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。骨小梁數(shù)目(Tb.N)明顯升高(P<0.05)

10、。各實(shí)驗(yàn)組骨小梁分離度(Tb.Sp)明顯降低(P<0.05),骨小梁厚度(Tb.Th)呈降低趨勢(shì),但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4、氟對(duì)大鼠骨組織中β-catenin及Lrp5、Runx2mRNA表達(dá)的影響
　　 與對(duì)照組相比各實(shí)驗(yàn)組β-catenin、Lrp5、Runx2mRNA表達(dá)含量升高,其中100mg/LF-組以及150mg/LF-組β-catenin、Lrp5mRNA表達(dá)含量較對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

11、P<0.05),Runx2mRNA表達(dá)含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5、氟對(duì)大鼠骨組織中β-catenin蛋白表達(dá)的影響
　　 在高倍鏡(40×)下可見(jiàn),與對(duì)照組相比染氟組大鼠成骨細(xì)胞中可見(jiàn)β-catenin陽(yáng)性表達(dá),主要表達(dá)于皮質(zhì)骨內(nèi)包被以及骨小梁包被的成骨細(xì)胞系。各實(shí)驗(yàn)組隨著染氟劑量的升高,陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目增多、范圍擴(kuò)大。
　　 結(jié)論:
　　 1、不同濃度(50mg/L、100mg/L、