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文檔簡介
1、大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的土傳性的毀滅病害。在我國,黑龍江、安徽、山東、河南、江蘇、浙江、福建、新疆等地區(qū)均有Phytophthora sojae的報道。黑龍江省是我國大豆的主產(chǎn)區(qū),且大豆疫霉根腐病在該省發(fā)病面積連年增加,嚴(yán)重危害我國大豆的生產(chǎn)。
迄今為止,防治該病最為有效的手段就是選用抗病品種。大豆疫霉菌毒力結(jié)構(gòu)趨于復(fù)雜化、生理小種進(jìn)化速度快;而常規(guī)的育種工作周期長,工作效
2、率低,抗性資源有限,很難滿足生產(chǎn)的需要。因此,解析大豆抗疫霉根腐病分子機理進(jìn)而利用抗病基因工程育種是解決該難題的有希望的途徑之一。
植物為了抵抗病原微生物的侵害,在長期進(jìn)化過程中,逐漸形成了一系列復(fù)雜而有效的保護(hù)機制和防御網(wǎng)絡(luò)。植物防衛(wèi)反應(yīng)中表達(dá)的基因主要是編碼病程相關(guān)蛋白(pathogenesisrelated proteins,PR蛋白)基因和植保素合成相關(guān)酶的基因。課題組以高抗大豆品種“綏農(nóng)10”為試驗材料構(gòu)建的受疫
3、霉菌誘導(dǎo)后差異表達(dá)的cDNA消減文庫的基礎(chǔ)上,選取了文庫中經(jīng)本地Blast比對后發(fā)現(xiàn)與其它植物的病程相關(guān)蛋白類基因具有較高同源性的高上調(diào)表達(dá)的EST序列進(jìn)行研究,并用RACE技術(shù)擴增了病程相關(guān)蛋白類基因PR10(pathogenesis-related protein10)基因和PRP(pathogenesis-related protein)基因,本研究在上述基礎(chǔ)上對兩個基因的功能進(jìn)行了初步研究,對豐富大豆病程相關(guān)蛋白基因理論和實踐抗
4、病基因工程育種都具有十分重要的意義。
具體研究結(jié)果如下:
1.將PR10和PRP基因構(gòu)建到pET-29b(+)原核表達(dá)載體上,在37℃,IPTG濃度0.5mM,誘導(dǎo)4h條件下,獲得以包涵體形式存在的融合蛋白,其大小約為17.14kDa和30kDa。將該His-PR10和His-PRP融合蛋白分離純化,成功復(fù)性后,進(jìn)行體外抑制大豆疫霉根腐病1號生理小種菌絲體生長試驗,結(jié)果表明:PR10和PRP基因編碼蛋白對大豆
5、疫霉1號生理小種菌絲生長具有抑制作用,PR10基因編碼蛋白在25μg時具有明顯的抑菌效果,而PRP基因編碼蛋白在35μg時具有明顯的抑菌效果。PR10蛋白所特有的P-Loop結(jié)構(gòu)域具有核苷酸酶活性,可以便RNA降解。PRP基因也具有核酸酶活性,可以降解RNA。
2.構(gòu)建了GFP融合表達(dá)載體pCAMBIA1302-PR10和pCAMBIA1302-PRP,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染洋蔥表皮細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果表明PR
6、10和PRP基因表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。
3.對本課題組已獲得的轉(zhuǎn)PR10和PRP基因T1代煙草進(jìn)行檢測,經(jīng)PCR檢測,獲得陽性植株6株,轉(zhuǎn)PR10和PRP基因的各3株。利用離體葉片接種法對煙草陽性植株接種煙草疫霉,結(jié)果證實轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性較對照煙草增強。
4.以感病大豆品種“東農(nóng)50”的子葉節(jié)為外植體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對pCAMBIA3301-PR10和pCAMBIA3301-PRP進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。獲得
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