大豆疫霉細胞自噬基因PsAtg6a和細胞凋亡相關基因的功能研究.pdf

1、正常的細胞死亡有助于維持生物體生理活動的運行。生物的細胞死亡包括細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)以及細胞壞死。而細胞程序性死亡又包括細胞凋亡和細胞自噬，其中細胞自噬是細胞內(nèi)保守的降解過程，這一過程可以將細胞內(nèi)損傷的細胞器或者廢棄的蛋白質等降解，生成的物質重新被細胞利用。在外部環(huán)境不利如饑餓條件，或者內(nèi)部壓力如損傷的細胞器的聚集，或者病原菌的侵入時，細胞自噬都能幫助細胞存活，抵抗壓力。細胞自噬的發(fā)生包括

2、誘導發(fā)生、自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合以及最終物質的降解等過程。現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬在許多真核生物如絲狀真菌、植物、果蠅、線蟲、昆蟲、人的生理病理方面都發(fā)揮著重要的作用。而細胞凋亡是生物體內(nèi)由基因控制的主動死亡的過程，大量研究表明它在生長發(fā)育及致病性等方面發(fā)揮著重要功能，但大豆疫霉的細胞凋亡和細胞自噬還知之甚少。
　　為了研究大豆疫霉中是否發(fā)生細胞自噬，之前研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以誘導細胞自噬的發(fā)生。通過PEG介導的大豆疫霉的穩(wěn)定

3、轉化獲得GFP-PsAtg8的過表達轉化子，通過雷帕霉素處理前后GFP-PsAtg8融合蛋白的位置變化來觀察細胞自噬的發(fā)生。熒光顯微鏡觀察結果表明對照組(DMSO)的菌絲熒光聚集較亮，而雷帕霉素處理后的菌絲中熒光分散，說明菌絲確實發(fā)生了細胞自噬。同時通過MDC染色法觀察大豆疫霉細胞自噬的發(fā)生，它是一種廣泛使用的自噬熒光染料。結果顯示與對照相比，經(jīng)雷帕霉素處理的菌絲中自噬體數(shù)量增多，熒光亮點增加。這兩種方法說明大豆疫霉中可以發(fā)生細胞自噬。

4、為了進一步探究細胞自噬是否參與到大豆疫霉的不同生長發(fā)育階段，利用MDC染色的方法觀察大豆疫霉不同生長發(fā)育階段細胞自噬的發(fā)生，包括菌絲、孢子囊形成、休止胞以及休止胞萌發(fā)。結果表明MDC染色結果發(fā)現(xiàn)初生孢子囊中MDC熒光強，而成熟的孢子囊的MDC熒光較弱。休止胞以及休止胞萌發(fā)階段MDC染色結果顯示休止胞的MDC熒光較弱，而休止胞萌發(fā)時MDC熒光增強，說明在孢子囊形成，休止胞萌發(fā)時細胞自噬過程被激活。我們由此可以推斷細胞自噬可能在大豆疫霉侵染

5、時發(fā)揮作用。
　　為了進一步研究細胞自噬在大豆疫霉產(chǎn)胞和致病性方面的作用，在大豆疫霉中鑒定了在侵染階段持續(xù)上調(diào)表達細胞自噬相關基因PsAtg6a。通過PEG介導的大豆疫霉原生質體轉化的方法獲得PsAtg6a沉默轉化子，并接種感病品種大豆黃化苗下胚軸。結果顯示與野生型P6497相比，PsAtg6a沉默后其致病力降低，用臺盼藍染侵染部位的表皮細胞發(fā)現(xiàn)吸器量減少。沉默細胞自噬相關基因PsAtg6a導致孢子囊的產(chǎn)生減少，結合之前MDC染色

6、結果顯示的孢子囊形成階段自噬增強這一結論，表明細胞自噬在孢子囊形成階段發(fā)揮重要的作用。通過上述研究，我們在大豆疫霉中初步證明了細胞自噬的發(fā)生，并且發(fā)現(xiàn)細胞自噬可能參與大豆疫霉孢子囊產(chǎn)生以及致病性，這些結果將會加深我們對大豆疫霉中細胞自噬對其生長發(fā)育和致病性影響的認識。
　　為了研究另一種程序性細胞死亡-細胞凋亡在大豆疫霉侵染過程中可能的作用，在大豆疫霉中鑒定到了四個細胞凋亡相關基因:PsCYCS、PsEndoG和PsAIF, Ps

7、TatDs，其中PsTatDs包括PsTatD1，PsTatD2，PsTatD3和PsTatD4。通過熒光定量PCR方法分析這7個基因在大豆疫霉侵染過程中的表達情況。PsAIF在侵染階段上調(diào)表達，PsEndoG在侵染前期有輕微上調(diào)表達，PsCYCS在侵染階段下調(diào)表達，PsTatD2和PsTatD3在侵染階段上調(diào)表達，PsTatD4在侵染前期下調(diào)表達而在侵染后期上調(diào)表達。結果顯示PsEndoG，PsCYCS和PsAIF，PsTatD2，P