大豆疫霉效應(yīng)分子的功能研究.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufman&Gerdman）引起的根腐病是大豆生產(chǎn)上的主要病害之一。大豆疫霉在形態(tài)上同真菌相似，呈絲狀生長(zhǎng)，但在進(jìn)化上與真菌相差甚遠(yuǎn)，和藻類進(jìn)化關(guān)系較近，屬于茸鞭生物界、卵茵門．大豆疫霉根腐病每年給全世界大豆生產(chǎn)造成約10-20億美元的經(jīng)濟(jì)損失。大豆疫霉在侵染寄主過程中能夠分泌包括無毒基因在內(nèi)的大量效應(yīng)分子，最近研究發(fā)現(xiàn)一類含有RxLR基序的效應(yīng)分子在卵茵與植物互作中發(fā)揮著重要作用．對(duì)

2、大豆疫霉全基因組進(jìn)行的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其基因組中含有超過350個(gè)RxLR類效應(yīng)分子（Avh, Avirulence homologue）。如此多的效應(yīng)分子如何在大豆疫霉和寄主互作過程中發(fā)揮作用目前尚不清楚。本文就大豆疫霉部分效應(yīng)分子對(duì)植物防衛(wèi)反應(yīng)的抑制、效應(yīng)分子在基因組中的多態(tài)性、效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄特征、功能域，以及部分效應(yīng)分子在大豆疫霉致病過程中的作用進(jìn)行了詳細(xì)分析。
　　 抑制植物過敏性壞死反應(yīng)的大豆疫霉效應(yīng)分子篩選：首先以能

3、夠引起煙草過敏性壞死反應(yīng)(HR)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子Bax、疫霉相關(guān)分子特征（PAMP）INF1，以及可直接引起植物HR反應(yīng)的效應(yīng)分子Avh238和Avh241作為激發(fā)子，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒表達(dá)系統(tǒng)在本氏煙上瞬時(shí)表達(dá)候選的50個(gè)Avh效應(yīng)分子，分析其對(duì)上述激發(fā)子誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)抑制譜的不同，可以將候選效應(yīng)分子分為八類。其中，有20個(gè)效應(yīng)分子可以同時(shí)抑制Bax、INFI、Avh238和Avh241在本氏煙上產(chǎn)生

4、的HR;有7個(gè)效應(yīng)分子抑制Bax、Avh238和Avh241在本氏煙上產(chǎn)生的HR;有2個(gè)效應(yīng)分子抑制INF1、Avh238、Avh241在本氏煙上產(chǎn)生的HR;7個(gè)效應(yīng)分子抑制Avh238和Avh241在本氏煙上產(chǎn)生的HR;1個(gè)效應(yīng)分子抑制INF1和Avh241在本氏煙上產(chǎn)生的HR;4個(gè)效應(yīng)分子只抑制Avh238;2個(gè)效應(yīng)分子僅抑制Avh241；還有7個(gè)對(duì)Bax、INF1、Avh238和Avh241在本氏煙上產(chǎn)生的HR均沒有抑制作用。結(jié)果

5、表明不同效應(yīng)分子可能作用于植物防衛(wèi)反應(yīng)的不同信號(hào)途徑。
　　 大豆疫霉效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄特征及序列多態(tài)性分析：為了進(jìn)一步了解大豆疫霉效應(yīng)分子在病菌與寄主互作中的作用和面臨寄主的選擇壓力，我們對(duì)本研究中篩選的效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄特征和序列多態(tài)性等進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，首先分析了50個(gè)效應(yīng)分子在大豆疫霉轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)庫中RNA積累情況，結(jié)果表明，多數(shù)效應(yīng)分子在大豆疫霉生長(zhǎng)發(fā)育、侵染階段均呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平；但無法檢測(cè)到Avh6、Avh

6、7bl和Avhl41等11個(gè)效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄水平；同時(shí)對(duì)具有不同功能的效應(yīng)分子進(jìn)行序列多態(tài)性分析，研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)效應(yīng)分子抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)的功能與其多態(tài)性之間具有密切的關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)效應(yīng)分子的功能與其自身存在的W基序關(guān)系密切，即具有抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)功能的效應(yīng)分子其W基序更易突變或缺失。
　　 能夠誘導(dǎo)植物壞死反應(yīng)的RxLR類效應(yīng)分子Avh241功能域分析：在對(duì)大豆疫霉效應(yīng)分子的篩選中，發(fā)現(xiàn)效應(yīng)分子Avh241可以直接誘導(dǎo)植物的壞死反

7、應(yīng)，推測(cè)其在大豆疫霉與寄主互作過程中可能被植物識(shí)別，為了進(jìn)一步研究植物對(duì)該效應(yīng)分子的識(shí)別位點(diǎn)，我們首先對(duì)Avh241進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Avh241具有典型的信號(hào)肽區(qū)域、保守的RxLR-dEER結(jié)構(gòu)以及2個(gè)W基序和2個(gè)Y基序，其編碼的氨基酸序列具有10個(gè)a螺旋和1個(gè)B折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)；基于以上分析對(duì)該效應(yīng)分子進(jìn)行缺失突變和隨機(jī)突變，結(jié)果表明：W、Y基序缺失以及B折疊缺失的突變體均不能在本氏煙上產(chǎn)生HR;此外，對(duì)具有誘導(dǎo)HR反應(yīng)的功

8、能片段Avh24159qs8（缺失信號(hào)肽和RxLR-dEER基序）進(jìn)行隨機(jī)突變，獲得1300多個(gè)突變體，對(duì)其進(jìn)行功能篩選、測(cè)序，結(jié)果顯示喪失產(chǎn)生HR反應(yīng)的且發(fā)生點(diǎn)突變的突變體有9個(gè)，同時(shí)通過Jnet軟件對(duì)Avh24159-188進(jìn)行solvent accessibility預(yù)測(cè)，結(jié)果表明在喪失功能的突變體中的W94、LllO等13個(gè)氨基酸位點(diǎn)對(duì)于維持正常的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)具有重要作用，其中，W94和Dis3氨基酸位點(diǎn)對(duì)于Avh241發(fā)揮激

9、發(fā)子功能具有重要作用。
　　 大豆疫霉效應(yīng)分子Avh38和Avh283的功能分析：對(duì)抑制植物HR反應(yīng)的效應(yīng)分子篩選、不同功能效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄以及序列多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)效應(yīng)分子Avh38和Avh283具有相同的抑制譜、相似的轉(zhuǎn)錄模式以及相同的選擇壓力，因此選擇上述效應(yīng)分子進(jìn)一步進(jìn)行功能研究。利用雙鏈RNA介導(dǎo)的基因瞬時(shí)沉默技術(shù)，對(duì)基因Avh38和Avh283進(jìn)行基因沉默，分別獲得沉默轉(zhuǎn)化子3個(gè)和2個(gè)，采用茵絲塊以及游動(dòng)孢子接種大豆