大豆疫霉GPCR-PIPK基因及PsIMPA和PsBTSl的功能研究.pdf

1、疫霉屬(Phytophthoraspp.)包含100多個(gè)種，絕大多數(shù)的疫霉菌是重要的植物病原菌。大豆疫霉(Phytophthorasojae)和致病疫霉(Phytophthorainfestans)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中兩種重要的病原菌。大豆疫霉在大豆的生產(chǎn)中引起根腐病和莖腐病，全球每年由大豆疫霉導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)10～20億美元。至今，大豆疫霉和致病疫霉仍然是大豆和馬鈴薯生產(chǎn)中的重要限制性因素。在不同的環(huán)境條件下，疫霉菌通過改變生活史，達(dá)到生存

2、和侵染寄主植物的目的。疫霉生活史不同階段的轉(zhuǎn)變需要首先感知外界環(huán)境及寄主植物的變化后，才能改變自身的的生理生化狀態(tài)，順利的進(jìn)入另外的生活史階段。大豆疫霉產(chǎn)生的游動(dòng)孢子和卵孢子在病害循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用，大豆疫霉如何感知外界的信號(hào)，如何調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，對(duì)于發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥防治的靶標(biāo)具有重要的意義。大豆疫霉的全基因組數(shù)據(jù)庫不斷的充實(shí)和完善，基因的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)也逐漸豐富，這些平臺(tái)為我們對(duì)這方面的研究提供了較為有利的條件。
　　新型G蛋

3、白偶聯(lián)受體PsGK4和PsGK5的功能分析和定位研究.卵菌中編碼有一類新的G蛋白偶聯(lián)受體，這類新型的基因在N端含有七次跨膜的GPCR結(jié)構(gòu)域，C端含有磷脂酸肌醇激酶(PIPK)的結(jié)構(gòu)域。大豆疫霉中編碼的GPCR-PIPK基因共有12個(gè)，我們對(duì)這12個(gè)基因利用瞬時(shí)沉默的方法進(jìn)行了初步的功能篩選，從其中選取了有表型變化的PsGK4和PsGK5進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，以進(jìn)行更為細(xì)致的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PsGK4沉默后影響游動(dòng)孢子向大豆根部的游動(dòng)和對(duì)異黃酮

4、的趨化性，游動(dòng)孢子的休止率上升到80％，萌發(fā)率下降到50％。PsGK5沉默后轉(zhuǎn)化子幾乎不能產(chǎn)生卵孢子，在PsGK5沉默轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基中外源添加卵磷脂和性激素也不能恢復(fù)卵孢子的產(chǎn)量。以上結(jié)果說明PsGK4和PsGK5分別在調(diào)控大豆疫霉的無性發(fā)育過程和有性生殖中發(fā)揮作用。通過對(duì)PsGK4和PsGK5融合紅色熒光蛋白進(jìn)行定位分析，發(fā)現(xiàn)PsGK4和PsGK5有相似的定位，均定位在細(xì)胞質(zhì)的小囊泡上，并且能夠在細(xì)胞質(zhì)中快速的移動(dòng)。
　　大豆疫

5、霉中親核蛋白家族的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和PsIMPA的功能分析.親核蛋白(importin)是真核生物中普遍存在的一類重要蛋白，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的物質(zhì)運(yùn)輸過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。在本研究中，利用酵母中的親核蛋白的基因序列，在大豆疫霉基因組中預(yù)測(cè)到14個(gè)親核蛋白基因，其中有兩個(gè)基因編碼親核蛋白α亞基，12個(gè)編碼親核蛋白β亞基。RNA-sequencing轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析表明，大多數(shù)的親核蛋白都具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，并且在孢子囊、游動(dòng)孢子、休止孢和

6、侵染大豆階段顯著上調(diào)表達(dá)。分別對(duì)親核蛋白α亞基和親核蛋白β亞基的進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)親核蛋白α亞基在進(jìn)化上屬于親核蛋白α1家族，親核蛋白β亞基中有2個(gè)基因與釀酒酵母的Crm1有較高的同源性，另外兩個(gè)與Kap104有較高的同源性，其余的編碼基因與酵母中的親核蛋白基因的同源性均很低。通過比較發(fā)現(xiàn)，大豆疫霉、致病疫霉和煙草疫霉三種疫霉中的親核蛋白都具有很高的序列相似性。隨后我們對(duì)PsIMPA進(jìn)行了沉默，發(fā)現(xiàn)PsIMPA的沉默轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速率比野生型大

7、豆疫霉減慢40％左右、菌絲出現(xiàn)更多的分支，分支之間的距離縮短、沉默轉(zhuǎn)化子不能形成孢子囊、卵孢子產(chǎn)量顯著降低以及致病能力下降等現(xiàn)象，說明了PsIMPA在大豆疫霉的發(fā)育以及致病過程中發(fā)揮著極為重要的作用。
　　大豆疫霉中GGPP生物合成途徑的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和PsBTS1的功能分析.煙草疫霉的α1和α2兩種性激素結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到了鑒定，兩者都屬于20個(gè)碳原子的二萜類物質(zhì)。煙草疫霉α1和α2的性激素與GGPP(geranylgeranyldi

8、phosphate)的結(jié)構(gòu)非常相似，而GGPP的生物合成途徑在釀酒酵母中已經(jīng)研究的十分清晰，參與GGPP合成途徑中的酶類也已經(jīng)得到了很好的研究。我們參考釀酒酵母中GGPP合成途徑，我們?cè)诖蠖挂呙怪蓄A(yù)測(cè)了GGPP的合成途徑，發(fā)現(xiàn)了GGPP合成途徑中的7個(gè)酶，其中GGPP合成酶基因PsBTS1與釀酒酵母中的同源基因ScBTS1具有大約40％的相似性。通過基因沉默的方法，我們獲得了PsBTS1的沉默轉(zhuǎn)化子，沉默轉(zhuǎn)化子的卵孢子產(chǎn)量顯著的降低。沉

9、默轉(zhuǎn)化子在菌絲的生長(zhǎng)速率、菌絲形態(tài)、孢子囊產(chǎn)生、游動(dòng)孢子的釋放以及致病性等方面沒有發(fā)生變化。PsBTS1沉默以后有可能影響了性激素的合成，從而導(dǎo)致了表型的變化。
　　綜上所述，在本文中我們對(duì)大豆疫霉中的4個(gè)基因PsGK4、PsGK5、PsIMPA和PsBTS1進(jìn)行了功能分析，發(fā)現(xiàn)這些基因參與調(diào)控了大豆疫霉的有性生殖和無性發(fā)育過程，這些基因在感受外界的信號(hào)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間物質(zhì)運(yùn)輸和性激素的合成過程中發(fā)揮著重要的作用，沉默這些基因