IGF-1：一種潛在的抗癲癇發(fā)作新靶標(biāo).pdf

1、第一部分IGF-1在顳葉癲癇患者及點燃大鼠腦組織中的表達(dá)
　　目的：研究IGF-1在難治性顳葉癲癇（TLE）患者顳葉皮質(zhì)中的表達(dá)，及IGF-1在化學(xué)點燃模型即匹羅卡品（PILO）誘導(dǎo)顳葉癲癇模型和戊四氮（PTZ）急性點燃模型海馬腦組織中的動態(tài)表達(dá)規(guī)律。
　　方法：人腦組織標(biāo)本源自課題組的癲癇腦庫，從中隨機(jī)抽取24例難治性 TLE患者顳皮質(zhì)標(biāo)本，12例對照組標(biāo)本。酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosor

2、bent assay,ELISA）用于檢測檢測IGF-1蛋白表達(dá)，熒光定量PCR（quantitative real time PCR,qRT-PCR）技術(shù)檢測IGF-1 mRNA表達(dá)水平。用ELISA和qRT-PCR檢測成年雄性SD大鼠IGF-1表達(dá)，動物隨機(jī)分為正常對照組（n=5）和癲癇組（SE后6h組、24h組、7d組、21d組、60d組,各組n=5），經(jīng)腹腔注射PILO誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus,SE

3、），構(gòu)建SE后顳葉癲癇動物模型。用PTZ大鼠急性點燃模型驗證急性期IGF-1的表達(dá)，分6h組（n=5）和24h組（n=5）。
　　結(jié)果：IGF-1 mRNA及蛋白在TLE患者顳葉皮質(zhì)中的表達(dá)較非癲癇對照組顳葉皮質(zhì)表達(dá)水平明顯增高，IGF-1 mRNA表達(dá)的相對量對照組為1.19±0.34，TLE組為2.46±1.48；IGF-1蛋白對照組為235.75±50.54 pg/mg，TLE組為311.58±101.79 pg/mg，（P

4、＜0.05）。PILO模型鼠IGF-1 mRNA相對水平在SE后24h、21d和60d三個時間點的表達(dá)顯著增高，對照組均值為1.03±0.05，24h組為2.15±0.46，21d組為2.69±0.55，60d組為3.57±0.64，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ELISA結(jié)果顯示IGF-1蛋白水平在PILO模型癲癇急性期（SE后6h和24h）和SRS后（SE后21d和60d）IGF-1蛋白水平表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）；對照組

5、為9.16±0.83，SE后6h組16.04±2.24，24h組19.98±2.18，21d組13.41±2.28，60d組為13.26±1.9（ng/mg蛋白）；PTZ模型GTCS6h和24h后IGF-1蛋白表達(dá)水平也顯著增高（P＜0.05），分別為14.05±2.03和13.96±3.58（ng/mg蛋白）。
　　結(jié)論：在顳葉癲癇患者和動物模型腦組織中 IGF-1表達(dá)均明顯增加，SE后IGF-1基因和蛋白的高表達(dá)可能參與了癲癇

6、的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第二部分癲癇研究新發(fā)現(xiàn)：IGF-1及其受體信號通路調(diào)控癲癇活動
　　目的：通過大鼠活體側(cè)腦室注射重組人胰島素樣生長因子（rhIGF-1），腹腔注射特異性IGF-1受體抑制劑（picropodophyllin, PPP），觀察其對PILO和PTZ模型鼠癲癇活動的影響。大鼠活體給予IGF-1受體下游信號通路MAPK-ERK抑制劑U0126和PI3K-AKT抑制劑LY294002，分別觀察其對PTZ模型鼠癲癇

7、活動的影響。
　　方法：所有動物麻醉后經(jīng)立體定位側(cè)腦室埋置微量注射導(dǎo)管，術(shù)后恢復(fù)一周，動物在清醒自由活動狀態(tài)下藥物干預(yù)，造模后觀察大鼠行為學(xué)變化。分組：對照組（n=13），側(cè)腦室注射等量生理鹽水；IGF-1組（n=13），側(cè)腦室注射rhIGF-110μg；PPP組（n=15），側(cè)腦室注射（NS），腹腔注射PPP20mg/kg體重；干預(yù)后1h分別腹腔注射PILO誘導(dǎo)SE。PTZ模型采用同樣的分組及干預(yù)方法（各組n=10）。PILO模

8、型觀察SE潛伏期，4級以上SE發(fā)作比率，最大發(fā)作評分（Racine score）和急性期死亡率。PTZ模型觀察驚厥發(fā)作潛伏期和發(fā)作比率。兩組均記錄腦電活動（n=3）。IGF-1下游信號干預(yù)分為對照組，U0126組（5μΜ,i.c.v.）， LY294002組（20μΜ,i.c.v.），U0126+ LY294002組（U01265μM+LY29400220μM,i.c.v.）（各組n=10）。干預(yù)后1h分別腹腔注射PTZ造模，觀察驚厥發(fā)

9、作潛伏期和發(fā)作比率。
　　結(jié)果：PILO模型對照組SE潛伏期均值為28.89±7.96(min)，IGF-1組為19.58±8.05(min)，PPP組為38.63±13.06(min)；用ANOVA多種樣本均數(shù)間比較顯示與對照組比較，IGF-1組潛伏期明顯縮短，PPP組潛伏期明顯延長（P＜0.05）。大鼠IV級以上發(fā)作比率顯示：對照組為9/12，IGF-1組為12/13，PPP組為8/15，IGF-1組和PPP組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)

10、差異。對照組最大發(fā)作評分3.38±1.94，IGF-1組為4.46±1.27， PPP組為2.53±2.0；大鼠急性期死亡率為IGF-1組30.77（4/13），對照組7.69％（1/13），PPP組沒有大鼠死亡，IGF-1組和PPP組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　PTZ模型對照組GTCS發(fā)病潛伏期均值為107.5±5.04(s)，IGF-1組為86.9±6.08(s)，PPP組為124.17±13.21(s)，IG

11、F-1+ PPP組為116.63±11.44(s)，與對照組比較，IGF-1組潛伏期明顯縮短，PPP組潛伏期明顯延長（P＜0.05）。GTCS發(fā)病比率IGF-1+PPP組為8/10，PPP組（6/10）與對照組（10/10）和IGF-1組（10/10）比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　PTZ模型IGF-1受體下游信號通路的活體干預(yù)研究顯示，對照組GTCS發(fā)病潛伏期(s)均值為92.6±8.09，LY294002組為109

12、.5±14.2，U0126組為105.83±8.75，LY294002+U0126組為122.5±16.67；與對照組比較，LY294002組和LY294002+ U0126組潛伏期均明顯延長， LY294002+U0126組與LY294002組和U0126組比較潛伏期也顯著延長（P＜0.05）。GTCS發(fā)病比率對照組為10/10，LY294002組為8/10、U0126組和LY294002+U0126組均為6/10；U0126組和LY

13、294002+U0126組與對照組比較均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：IGF-1增加PILO誘導(dǎo)SE發(fā)作比率，縮短潛伏期，增加最大發(fā)作評分和死亡率，縮短PTZ模型GTCS潛伏期，說明IGF-1增加可能有增加癲癇發(fā)作敏感性和SE嚴(yán)重程度的作用。PPP延長PILO誘導(dǎo)SE潛伏期，減少SE發(fā)作比率，降低SE評分和急性期大鼠死亡率；PPP，U0126和LY294002在延長PTZ模型GTCS潛伏期，減少GTCS發(fā)作比率方面

14、都有一定效果；說明抑制 IGF-1受體和下游信號通路可能有抑制癲癇活動的效果。
　　第三部分IGF-1及其受體信號通路在癲癇發(fā)作中的細(xì)胞與分子機(jī)制
　　目的：通過離體海馬腦片IGF-1和PPP干預(yù)行膜片鉗技術(shù)研究二者對癲癇模型海馬興奮性的影響，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測IGF-1受體及下游信號活化狀態(tài)，探討IGF-1受體及其下游信號通路參與癲癇活動的分子機(jī)制。
　　方法：用出生后14～16天乳鼠構(gòu)建離體海馬腦片，無鎂誘導(dǎo)癲

15、癇模型（對照組），IGF-1和PPP干預(yù)組（各組N=8-12），均記錄場電位（fEPSP）軌跡，分析fEPSP斜率，記錄無鎂誘導(dǎo)癇樣放電頻率。觀察微小興奮性突觸后電流（mEPSC）和興奮性突觸后電流（EPSC），包括：AMPAR和NMDAR介導(dǎo)的EPSC。IGF-1組在無鎂人工腦脊液及記錄液中加入IGF-1100ng/ml30min后記錄，PPP組無鎂誘導(dǎo)前加PPP5μM孵育1-2h，再給予無鎂誘導(dǎo)，同時加IGF-1處理。用Wester

16、n blot技術(shù)檢測LiCL-PILO模型，正常對照、SE后6h組、24h組、7d組、21d組和60d組海馬pIGF-1R/IGF-1R、pERK1/2/ERK1/2及pAKT/AKT蛋白水平的變化；檢測IGF-1和PPP干預(yù)后6h和24h pIGF-1R/IGF-1R、pERK1/2/ERK1/2及pAKT/AKT蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：IGF-1誘導(dǎo)大鼠海馬腦片fEPSP斜率增加，增加無鎂誘導(dǎo)癇樣放電頻率（P＜0.05）；

17、PPP預(yù)處理，降低IGF-1誘導(dǎo)的fEPSP斜率增加，并減少無鎂誘導(dǎo)癇樣放電頻率（P＜0.05）。與對照組比較，IGF-1增加mEPSC頻率，PPP降低IGF-1誘導(dǎo)的mEPSC頻率增加。mEPSC振幅累積分布曲線顯示：和對照組組比較IGF-1組大鼠海馬腦片mEPSC振幅累積分布曲線有顯著偏移現(xiàn)象。IGF-1增加AMPAR和NMDAR介導(dǎo)的興奮性突觸后電流幅值，PPP可部分反轉(zhuǎn)IGF-1誘導(dǎo)的EPSC的幅值。與正常對照組比較，PILO模

18、型SE后急性期IGF-1R、ERK1/2及 AKT磷酸化水平增加（P＜0.05）；IGF-1干預(yù)進(jìn)一步增加SE后6h和24hIGF-1R、ERK1/2及 AKT磷酸化水平（P＜0.05），而PPP則有抑制作用（P＜0.05）。
　　結(jié)論：IGF-1誘導(dǎo)大鼠海馬腦片興奮性增加，PPP對IGF-1效應(yīng)有一定的逆轉(zhuǎn)作用，說明IGF-1及其受體通路可能通過興奮性突觸后電位起作用。IGF-1及PPP影響癲癇活動，可能通過IGF-1R及其下游

19、ERK1/2及AKT信號通路的激活來實現(xiàn)的。
　　第四部分miRNA-9調(diào)控IGF-1可能是抗癲癇發(fā)作新的治療方法
　　目的：課題組前期miRNAs芯片表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)TLE患者顳葉皮質(zhì)與對照組比較miRNA-9存在差異表達(dá)，靶基因預(yù)測IGF-1是miRNA-9的靶基因。實驗檢測TLE與對照組患者顳葉皮質(zhì)和PILO模型miRNA-9表達(dá)，并驗證二者的靶標(biāo)關(guān)系。
　　方法：用測定IGF-1 mRNA同批RNA，用 qRT-

20、PCR技術(shù)檢測miRNA-9表達(dá)水平。與廣州銳博生物有限公司合作，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證靶基因。
　　結(jié)果：TLE患者顳葉皮質(zhì)miRNA-9表達(dá)較對照組降低，但無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。PILO模型miRNA-9在SE后6h和7d組較對照組表達(dá)顯著增高（P<0.05），其它時間點表達(dá)差異不模型；雙熒光素酶報告系統(tǒng)報告IGF-1是miRNA-9的靶基因。
　　結(jié)論：miRNA-9和IGF-1表達(dá)在一定程度上有反向關(guān)