補(bǔ)腎填精方對(duì)卵巢早衰模型小鼠作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)腹腔注射順鉑建立小鼠卵巢早衰模型，觀察中藥補(bǔ)腎填精方不同劑量對(duì)卵巢早衰模型小鼠免疫系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)的影響，探討其治療效果和作用機(jī)制。
　　 方法：將135只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)正常組)、模型組、強(qiáng)的松組、雌激素組、中藥高劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)高劑量組)、中藥中劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)中劑量組)、中藥低劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)低劑量組)，除正常對(duì)照組外均采用連續(xù)腹腔注射順鉑7天建立卵巢早衰模型并陰道細(xì)胞涂片判定小鼠雌激素水平；造模結(jié)束后第4

2、天開(kāi)始灌胃，連續(xù)30天，中藥高、中、低劑量組分別給予不同濃度的補(bǔ)腎填精方水煎劑灌胃，強(qiáng)的松組、雌激素組分別給予強(qiáng)的松和乙底酚水溶液灌胃，正常對(duì)照組和模型組生理鹽水灌胃；灌胃結(jié)束第2天處死小鼠，稱(chēng)量體重和脾、卵巢、胸腺的重量，卵巢組織采用HE染色病理觀察和超微病理觀察，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清雌激素(E2)、促卵泡成熟素(FSH)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢細(xì)胞凋亡率，SAP法檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)和自然殺傷細(xì)胞(NKT

3、cell)，ELISA法檢測(cè)小鼠抗卵巢抗體(AOAb)，免疫組化法檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控因子Bcl-2和FasL在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜的表達(dá)，并進(jìn)行圖像分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.造模后的小鼠體重均較正常組明顯降低，治療后逐漸回升，以中劑量組和雌激素組最為明顯；與正常組比較，模型小鼠的陰道細(xì)胞涂片呈雌激素缺乏征象；模型組FSH水平顯著升高(P＜0.01)， E2的水平低于正常組(P＜0.01)；與模型組比較，中劑量組、雌

4、激素組E2升高(P＜0.05)，F(xiàn)SH顯著降低(P＜0.01)；中劑量組和雌激素組以及強(qiáng)的松組相比較，E2和FSH均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2.各組CD3+細(xì)胞水平比較，模型組和各治療組無(wú)顯著性差異；模型組外周血CD4+、CD8+細(xì)胞水平及其比值與正常組比較有顯著性差異，CD4+細(xì)胞水平降低，CD8+細(xì)胞水平明顯升高，CD4+/CD8+明顯降低；治療后各組CD4+細(xì)胞水平均有上升、CD8+細(xì)胞水平均有下降、CD4+

5、/CD8+比值明顯升高，和模型組比較，以中劑量組和雌激素組、強(qiáng)的松組最為明顯；中劑量組和雌激素組以及強(qiáng)的松組比較，無(wú)明顯差異。
　　 3.與正常組比較，各組均出現(xiàn)NKTC上升情況，有極顯著性差異(P＜0.01)；與模型組比較，各治療組NKTC下降，以中劑量組、雌激素組和強(qiáng)的松組最為顯著(P＜0.01)；與雌激素組比較，中劑量組NKTC下降明顯(P＜0.01)。
　　 4.模型組和各治療組AOAb含量均有增高，和正常組相比

6、，模型組、高、低劑量組和強(qiáng)的松組有顯著差異(P＜0.01)；與模型組比較，各治療組有不同程度的降低，其中雌激素組差異最為顯著(P＜0.01)，中劑量組有顯著性差異(P＜0.05)；和雌激素組比較，中劑量組無(wú)顯著性差異。
　　 5.卵巢顆粒細(xì)胞胞漿和細(xì)胞膜上均可見(jiàn)Bcl-2和FasL表達(dá)的棕黃色顆粒。和正常組相比較，造模后各組Bcl-2均表達(dá)減弱，而以模型組最明顯，幾乎不表達(dá)；和模型組比較，各治療組均可見(jiàn)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)，但弱于

7、正常組，差異顯著(P＜0.01)；中藥各組和雌激素組比較，中劑量組Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度無(wú)差異(P＞0.05)，高、低劑量組Bcl-2表達(dá)減弱，有顯著性差異(P＜0.05)；中藥各組和強(qiáng)的松組比較有差異顯著，Bcl-2表達(dá)弱于強(qiáng)的松組(P＜0.01)。與Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果相反，和正常組比較，模型組和各治療組FasL均表達(dá)增強(qiáng)，模型組呈現(xiàn)極強(qiáng)表達(dá)現(xiàn)象，(P＜0.01)；和模型組比較，各治療組均可見(jiàn)FasL陽(yáng)性表達(dá)減弱，有極顯著差異，(P＜

8、0.01)；和雌激素組比較，中劑量組無(wú)差異(P＞0.05)，中藥各組之間比較，以中劑量組FasL表達(dá)最弱(P＜0.01)。
　　 6.與正常組比較，模型動(dòng)物均出現(xiàn)卵巢細(xì)胞凋亡率上升，有顯著性差異(P＜0.01)；和模型組比較，各治療組卵巢細(xì)胞凋亡率下降，以中劑量組、雌激素組、強(qiáng)的松組最為明顯(P＜0.05)；中劑量組和雌激素組以及強(qiáng)的松組比較，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 7.與正常組比較，各組小鼠脾臟指數(shù)變化不

9、明顯，模型組和各治療組胸腺指數(shù)均降低，有顯著差異(P＜0.01)；模型組卵巢指數(shù)降低(P＜0.05)。與模型組比較，胸腺指數(shù)和卵巢指數(shù)均升高，中劑量組胸腺指數(shù)升高明顯(P＜0.01)，雌激素組卵巢臟器指數(shù)升高明顯(P＜0.05)；中劑量組和雌激素組比較，胸腺指數(shù)和卵巢指數(shù)均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 8.病理檢查發(fā)現(xiàn)模型組小鼠雙側(cè)卵巢均有不同程度萎縮，顏色蒼白，HE染色后光鏡下觀察可見(jiàn)卵巢體積明顯縮小，卵巢組織呈現(xiàn)“纖維

10、化”樣改變，間質(zhì)增生，卵巢中生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡數(shù)明顯減少，幾乎無(wú)成熟卵泡，閉鎖卵泡增加，和正常組比較有明顯差異；各治療組成熟卵泡較模型組增加，閉鎖卵泡減少，間質(zhì)纖維化程度減輕。觀察卵巢的超微結(jié)構(gòu)：模型組卵泡內(nèi)見(jiàn)凋亡細(xì)胞；透明帶狹窄、模糊；卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞明顯變小，排列紊亂，大小不一，與透明帶之間距離增大；顆粒細(xì)胞之間連接增寬；胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，線(xiàn)粒體明顯腫脹，嵴模糊不清；各治療組和模型組比較均有好轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)論：
　　

11、1.所制作模型為卵巢早衰病證結(jié)合小鼠模型，存在免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的改變。
　　 2.補(bǔ)腎填精方水煎劑可使POF小鼠增重，胸腺指數(shù)、卵巢指數(shù)增加，E2升高、FSH下降，CD4+增高、CD8+細(xì)胞下降、增加CD4+/CD8+比值，降低NKTC，下調(diào)AOAb，使Bcl-2在卵泡顆粒細(xì)胞膜表達(dá)增強(qiáng)，F(xiàn)asL表達(dá)減弱，減少卵巢細(xì)胞凋亡率。
　　 3.補(bǔ)腎填精方治療POF的可能作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌、細(xì)胞免疫和體液免疫，從多途