嗜肺軍團(tuán)菌、甲型H1N1流感病毒熒光定量檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、目的：建立對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌、甲型H1N1流感病毒快速、特異、靈敏的檢測(cè)方法，為臨床診斷、環(huán)境安全監(jiān)測(cè)和進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫等提供有效地檢測(cè)手段。
　　 方法：根據(jù)國(guó)內(nèi)唯一探針專利技術(shù)——復(fù)合探針技術(shù)原理，找到病原微生物的特異基因序列，并以此為靶序列進(jìn)行特異引物和探針設(shè)計(jì)合成，對(duì)相應(yīng)病原微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，并對(duì)鎂離子濃度、引物濃度、退火溫度、熒光探針及淬滅探針用量等影響熒光定量擴(kuò)增檢測(cè)的各因素進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。
　　 結(jié)果：為獲

2、得嗜肺軍團(tuán)菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照，我們構(gòu)建了含mip基因108bp目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)際應(yīng)用效果良好。建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)有陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)非嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)有陰性結(jié)果。為提高擴(kuò)增效率及靈敏度對(duì)反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化，確定甲酰胺含量為3％，Mg2+濃度5 mmol/L，上下游引物0.5μmol/L，熒光探針0.2μmol/L，淬滅探針0.4μmol/L，53℃退火30s。采用該方法最低可檢測(cè)

3、到102CFU/ml細(xì)菌，在模擬污水檢測(cè)中，檢測(cè)靈敏度為102 CFU/ml。
　　 為獲得甲型H1N1流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照，我們構(gòu)建了含HA基因540bp目的擴(kuò)增片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA，經(jīng)驗(yàn)證使用效果良好。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR定量檢測(cè)反應(yīng)體系中，最佳Mg2+濃度為4.0 mmol/L，反轉(zhuǎn)錄酶混合物為50U/μl superscriptⅢ與2.0U/μl Taq酶混合，50℃反轉(zhuǎn)錄20 min，52℃退火20

4、 s。該方法對(duì)22株非甲型H1N1流感病毒株進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果均為陰性，對(duì)4株甲型H1N1流感病毒樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，經(jīng)重復(fù)性檢測(cè)CV％值小于5％。最低可以檢出10 copies/μl體外轉(zhuǎn)錄RNA。在對(duì)38份臨床樣本的檢測(cè)中，符合率為100％。并篩選出一種效果優(yōu)良、價(jià)格低廉的核酸提取試劑盒。
　　 結(jié)論：復(fù)合探針熒光定量檢測(cè)技術(shù)能有高效、特異、靈敏地定量檢測(cè)出嗜肺軍團(tuán)菌及甲型H1N1流感病毒，本研究建立的檢測(cè)方法對(duì)疾病快速診斷、環(huán)