嗜肺軍團(tuán)菌、甲型H1N1流感病毒熒光定量檢測技術(shù)研究.pdf

1、目的：建立對嗜肺軍團(tuán)菌、甲型H1N1流感病毒快速、特異、靈敏的檢測方法，為臨床診斷、環(huán)境安全監(jiān)測和進(jìn)出口檢驗檢疫等提供有效地檢測手段。
　　 方法：根據(jù)國內(nèi)唯一探針專利技術(shù)——復(fù)合探針技術(shù)原理，找到病原微生物的特異基因序列，并以此為靶序列進(jìn)行特異引物和探針設(shè)計合成，對相應(yīng)病原微生物進(jìn)行實時熒光定量檢測，并對鎂離子濃度、引物濃度、退火溫度、熒光探針及淬滅探針用量等影響熒光定量擴增檢測的各因素進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。
　　 結(jié)果：為獲

2、得嗜肺軍團(tuán)菌實時熒光定量PCR檢測的陽性對照，我們構(gòu)建了含mip基因108bp目的擴增片段的重組質(zhì)粒，經(jīng)驗證實際應(yīng)用效果良好。建立的實時熒光定量PCR檢測方法對嗜肺軍團(tuán)菌檢測有陽性結(jié)果，對非嗜肺軍團(tuán)菌檢測有陰性結(jié)果。為提高擴增效率及靈敏度對反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化，確定甲酰胺含量為3％，Mg2+濃度5 mmol/L，上下游引物0.5μmol/L，熒光探針0.2μmol/L，淬滅探針0.4μmol/L，53℃退火30s。采用該方法最低可檢測

3、到102CFU/ml細(xì)菌，在模擬污水檢測中，檢測靈敏度為102 CFU/ml。
　　 為獲得甲型H1N1流感病毒實時熒光定量PCR檢測的陽性對照，我們構(gòu)建了含HA基因540bp目的擴增片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA，經(jīng)驗證使用效果良好。實時熒光RT-PCR定量檢測反應(yīng)體系中，最佳Mg2+濃度為4.0 mmol/L，反轉(zhuǎn)錄酶混合物為50U/μl superscriptⅢ與2.0U/μl Taq酶混合，50℃反轉(zhuǎn)錄20 min，52℃退火20

4、 s。該方法對22株非甲型H1N1流感病毒株進(jìn)行檢測結(jié)果均為陰性，對4株甲型H1N1流感病毒樣品檢測結(jié)果均為陽性，經(jīng)重復(fù)性檢測CV％值小于5％。最低可以檢出10 copies/μl體外轉(zhuǎn)錄RNA。在對38份臨床樣本的檢測中，符合率為100％。并篩選出一種效果優(yōu)良、價格低廉的核酸提取試劑盒。
　　 結(jié)論：復(fù)合探針熒光定量檢測技術(shù)能有高效、特異、靈敏地定量檢測出嗜肺軍團(tuán)菌及甲型H1N1流感病毒，本研究建立的檢測方法對疾病快速診斷、環(huán)