霉酚酸對骨髓干細胞作用及霉酚酸作用靶點的基因多態(tài)性研究.pdf

1、霉酚酸(MPA)是霉酚酸酯(MMF)在體內(nèi)代謝后的活性成分，其作用靶點是次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)，通過特異性抑制IMPDH，可以耗竭細胞內(nèi)鳥嘌呤核苷酸和脫氧鳥嘌呤核苷酸，進而阻斷DNA和RNA的合成。淋巴細胞高度依賴嘌呤從頭合成途徑，所以對MPA作用非常敏感。MMF做為一種強效安全的免疫抑制劑，目前廣泛應用于實體臟器移植和異基因造血干細胞移植。在異基因造血干細胞移植中，MMF廣泛用于預防排斥反應和急性移植物抗宿主病，也用于治療

2、移植物抗宿主病。而在異基因造血干細胞移植中，骨髓中的兩種干細胞-造血干細胞和間充質(zhì)干細胞起著極其重要的作用。造血干細胞是異基因造血干細胞移植中重建造血和免疫的種子細胞，而間充質(zhì)干細胞不僅是造血微環(huán)境的重要組成細胞，而且是近年來異基因造血干細胞移植領域的研究熱點之一。研究表明間充質(zhì)干細胞共移植可以促進造血植入、降低移植物抗宿主病的發(fā)生，而且間充質(zhì)干細胞還用于治療激素耐藥重度急性GVHD，Ⅱ期臨床研究顯示了良好的應用前景。MMF對這兩種骨髓

3、干細胞有什么作用？MMF應用的一個明顯的不良反應是血液系統(tǒng)毒性，是不是與MMF對造血于細胞的作用有關？目前的相關研究還不能解釋該問題。本研究旨在研究MPA對間充質(zhì)干細胞和造血干細胞的作用，并探索其作用的機制，為臨床更好應用MMF提供實驗依據(jù)。MPA的作用靶點是IMPDH酶，IMPDH酶有兩種亞型：IMPDHⅠ和IMPDHⅡ，IMPDHⅠ組成性表達于所有細胞，而IMPDHⅡ表達于部分細胞，與細胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化有關。IMPDHⅠ在胞內(nèi)嘌呤

4、合成中起主要作用，也是MPA作用的主要靶點。IMPDHⅠ單核苷酸多態(tài)性(SNP)近來引起研究的關注，Wang等報道在腎臟移植中患者IMPDHⅠ基因單核苷酸多態(tài)性與腎臟排斥反應相關。IMPDHⅠ單核苷酸多態(tài)性會不會影響MPA在異基因造血干細胞移植中的作用？我們選擇了IMPDHⅠ基因在腎臟移植中與急性移植物失功相關的單核苷酸突變位點和在中國人群中突變發(fā)生率在20％以上的共4個單核苷酸突變位點，收集本骨髓移植中心自2001年至2009年移植供

5、受者的基因組DNA，檢測供受者IMPDHⅠ基因單核苷酸多態(tài)性的分布頻率，并分析其與異基因造血干細胞移植急性移植物抗宿主病的發(fā)生風險的關系。第一章霉酚酸對入骨髓來源的間充質(zhì)干細胞作用研究
　　 本部分研究首先采用CCK-8方法分析霉酚酸對人骨髓來源的MSCs增殖的影響。結(jié)果顯示：濃度1μmol/L-100μmol/L的MPA對間充質(zhì)干細胞具有生長抑制作用，且其抑制作用呈現(xiàn)時間濃度依賴效應。為研究MPA抑制MSCs增殖的機制，我們在

6、培養(yǎng)體系內(nèi)添加鳥嘌呤核苷(Guo，100pmol/L)，結(jié)果顯示鳥嘌呤核苷逆轉(zhuǎn)了MPA的抑制增殖作用，加Guo組與相應濃度的MPA組相比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時我們用AnnexinV流式細胞分析技術(shù)檢測MPA各濃度組的凋亡情況，在作用的48小時和7天時間，10μmol/L和100μmol/L MPA濃度組的凋亡情況與相應對照組相仿(P>0.05)，表明MPA不誘導MSCs細胞凋亡。接下來我們用CCK-8方法檢測T-淋巴細胞

7、、成纖維細胞和MSCs對MPA作用的敏感性，結(jié)果顯示在作用的第6天上述各組細胞的IC50分別為0.20μmol/L、1.54μmol/L和2.47μmmol/L。為了揭示MSCs、成纖維細胞對MPA作用敏感的原因，我們用RT-PCR方法分析這兩種細胞IMPDHⅠ和IMPDHⅡ的表達情況，結(jié)果顯示這兩種細胞均表達IMPDHⅠ和IMPDHⅡ。
　　 接下來我們研究MPA對MSCs成骨分化、成脂分化和成軟骨分化的影響。Vonkossa

8、染色和鈣定量顯示MPA抑制MSCs的成骨分化，real-time PCR方法定量分析Osteopontin和BMP-2的表達，二者表達也呈劑量依賴性降低。添加鳥嘌呤核苷(100μmol/L)則逆轉(zhuǎn)了MPA對MSCs成骨分化的抑制。為進一步研究MPA抑制MSCs成骨分化的具體機制，我們用real-time PCR方法定量檢測Runx2、Osterix和ATF4，結(jié)果顯示Runx2、Osterix在誘導7天和14天表達均降低，western

9、-blot證實二者蛋白表達降低，添加Guo后表達得到恢復。MPA對MSCs成脂分化沒有影響，油紅O染色顯示MPA各濃度組成脂出現(xiàn)，脂滴定量顯示MPA各濃度組與對照組差別無統(tǒng)計意義(P>0.05)，real-time PCR檢測adipophilin和leptin顯示，MPA作用下二者表達與對照組沒有差別(P>0.05)。蕃紅O染色和real-time PCR方法定量檢測aggrecan和collagenⅡ顯示MPA對MSCs成軟骨分化沒

10、有影響。第二章霉酚酸對人造血干祖細胞作用研究
　　 集落形成細胞（colony-forming cell，CFC）是評估造血細胞功能的實驗室金標準，是用來檢測造血干祖細胞增殖分化的功能指標。本部分研究首先探討MPA對造血干祖細胞集落形成的影響。在MPA濃度0.1-5μmol/L濃度范圍內(nèi)，MPA對集落細胞總數(shù)、紅細胞集落形成單位數(shù)目(CFU-E)、爆式紅細胞集落形成單位數(shù)目(BFU-E)、粒細胞-巨噬細胞形成單位數(shù)目(CFU-G

11、M)均無影響，在10μmol/L時上述細胞集落總數(shù)和各系集落數(shù)目開始降低(P<0.05)，50和100μmol/L時幾乎消失；粒細胞-紅細胞-巨噬細胞-巨核細胞集落形成單位數(shù)目(CFU-GEMM)則從5μmol/L時開始減少(P<0.05)，50和100μmol/L時消失。在MPA各濃度組添加鳥嘌呤核苷(200μmol/L)，集落細胞總數(shù)、CFU-E、BFU-E和CFU-GM數(shù)目均得到恢復(P<0.05)；對CFU-GEMM來說，10μ

12、mol/L組添加Guo組得到恢復，而50和100μmol/L組添加Guo未得到恢復，這可能與CFU-GEMM在誘導體系中數(shù)目較少有關。這說明Guo可以逆轉(zhuǎn)MPA對造血干細胞集落形成的抑制。為進一步檢測MPA對造血干祖細胞的作用，采用7-AAD/AnnexinV、CD34染色，流式細胞術(shù)檢測CD34+細胞細胞的凋亡情況。培養(yǎng)48小時后，10μmol/L組和100μmol/L組CD34+細胞中凋亡細胞的百分數(shù)分別為5.26士0.95和3.5

13、8士0.93，與對照祖4.78士1.46％相仿(P>0.05)；培養(yǎng)96小時后，10μmol/L組和100μmol/L組CD34+細胞中凋亡細胞分別為15.44士1.81和16.01士2.73，與對照祖13.77士3相仿(P>0.05)。說明MPA不能引起CD34+細胞發(fā)生凋亡。第三章Ⅰ型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶的基因多態(tài)性在異基因造血干細胞移植急性移植物抗宿主病中的作用研究
　　 目前MMF在異基因造血干細胞移植中廣泛應用于預防和

14、治療aGVHD，而研究已證實個體間IMPDH的活性存在存在較大差異，因此我們設想IMPDHⅠ基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能影響IMPDH的活性，導致個體間MMF作用的差異，可能與GVHD的發(fā)生風險相關。我們選擇本移植中心自2001年1月至2009年3月連續(xù)續(xù)受異基因造血干細胞移植的患者及其供者，共240對。其中包括接受無關供者移植(URD)的患者及其供者138對，接受HL

15、A全相合同胞供者移植(Sib)的患者及其供者102對。留取供者和患者移植前外周血樣，提取基因組DNA，我們選擇檢測文獻報道IMPDHⅠ基因在腎臟移植中與急性移植物失功相關的SNP位點和在中國人群中突變發(fā)生率在20％以上的共4個SNP位點：內(nèi)含子7(IVS7)+125 G>A(rs2278293)；內(nèi)含子8(IVS8)-106G>A(rs2278294)；外顯子15(Exon15)1572G>A(rs2228075)和5側(cè)翼序列C>T(r

16、s714510)，分析其與異基因造血干細胞移植急性移植物抗宿主病的關系。我們的結(jié)果證實患者在IMPDHⅠ基因IVS8-106位點為G/G基因型的aGVHD的發(fā)生率明顯高于基因型為A/A和G/A的患者，多因素分析亦證實患者在IMPDHⅠ基因IVS8-106位點為G/G基因型是aGVHD發(fā)生的危險因素((RR=2.018，95％CI:1.354-3.009，P=0.001)。本研究未發(fā)現(xiàn)其他3個位點的基因多態(tài)性與aGVHD的發(fā)生風險相關，可