兔膀胱移行細(xì)胞原代培養(yǎng)及其與絲素膜相容性的研究.pdf

1、組織工程是一門新興的綜合性學(xué)科，它應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，研究和開(kāi)發(fā)修復(fù)損傷組織和改善其功能的替代物。通過(guò)少量組織細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增達(dá)到一定數(shù)量后，接種到具有一定空間結(jié)構(gòu)的支架上，構(gòu)成有生命活力的細(xì)胞支架復(fù)合物，移植到體內(nèi)以達(dá)到修復(fù)或替代組織損傷的目的。組織工程是人類治療組織、器官功能衰退和缺失的研究方向。近十幾年來(lái)，泌尿系統(tǒng)組織工程有了迅速的進(jìn)展。國(guó)外學(xué)者已經(jīng)開(kāi)始研究組織工程化膀胱、輸尿管與尿道，并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)器官的替代

2、。由于正常膀胱上皮細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)微環(huán)境復(fù)雜、不容易在體外復(fù)制，使得種子細(xì)胞的大量擴(kuò)增成為困擾國(guó)內(nèi)眾多研究者的一大難題。 研究背景： 泌尿系統(tǒng)器官由于先天性異常或后天性損害導(dǎo)致的畸形或缺損(例如：尿道下裂、泄殖腔外翻、神經(jīng)原性膀胱、間質(zhì)性膀胱炎和膀胱癌等)需要進(jìn)行重建或修復(fù)，盡可能恢復(fù)受損器官的結(jié)構(gòu)和功能。以膀胱為例，過(guò)去有很多種方法對(duì)容量小和低順應(yīng)性膀胱進(jìn)行修復(fù)，例如應(yīng)用大腸、小腸以及胃對(duì)病理性膀胱進(jìn)行修復(fù)，但這些方法存在

3、許多并發(fā)癥，如慢性感染、高氯性代謝性酸中毒、黏液分泌過(guò)多、形成結(jié)石、磷酸鈣的代謝異常、胃腸功能的紊亂以及膀胱成型術(shù)后仍然有膀胱穿孔和膀胱癌復(fù)發(fā)的可能。產(chǎn)生這些并發(fā)癥的原因就在于：①膀胱與胃腸道的上皮組織功能的不同；②胃腸道黏膜接觸面發(fā)生了改變。目前有很多種修復(fù)方法都是為克服這些并發(fā)癥的發(fā)生，其中包括帶蒂組織移植物修復(fù)和游離組織移植物修復(fù)，游離組織移植物包括皮膚、筋膜、腹膜、心包膜、小腸黏膜下層和脫細(xì)胞基質(zhì)。利用這些移植物修復(fù)膀胱的原理是

4、認(rèn)為膀胱移行上皮細(xì)胞有再生功能，這些移植物能作為一個(gè)三維支架，膀胱移行上皮細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)，最終形成正常膀胱組織。另外還有很多人工合成可降解生物支架：聚乳酸、聚羥基乙酸和聚乳酸與聚羥基乙酸的共聚物。不幸的是單純用這些移植物修復(fù)膀胱的效果并不好，于是在此基礎(chǔ)上構(gòu)思出一種新的方法修復(fù)缺損膀胱，就是將自體膀胱移行上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在體外擴(kuò)增再種植到支架上形成細(xì)胞支架復(fù)合物，最后將細(xì)胞支架復(fù)合物移植到體內(nèi)完成缺損膀胱的修復(fù)。所以隨著細(xì)胞生物學(xué)

5、、組織材料科學(xué)和工程學(xué)的不斷發(fā)展，在不久的將來(lái)泌尿系器官缺損的修復(fù)將會(huì)取得關(guān)鍵性的突破。 研究目的： 1.目前組織工程技術(shù)中分種植細(xì)胞技術(shù)和不種植細(xì)胞技術(shù)兩種，其中種植細(xì)胞技術(shù)是指通過(guò)活檢取得宿主的原代細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增，再將其種植到可降解的生物膜上，一段時(shí)間體外培養(yǎng)后，移植回宿主體內(nèi)，最終形成有功能的組織；而不種植細(xì)胞技術(shù)是指直接將生物可降解材料植入宿主組織缺損部位，通過(guò)宿主自身的再生能力達(dá)到組織再生的目的。但有研究表

6、明不種植細(xì)胞技術(shù)在膀胱修復(fù)重建中只是短期效果好，而長(zhǎng)期效果不理想。隨著時(shí)間的推移不種植細(xì)胞修復(fù)重建的膀胱表現(xiàn)出的不足有：膀胱逼尿肌的再生非常有限，大量膠原組織沉積導(dǎo)致瘢痕纖維化，最終導(dǎo)致膀胱容量減小以及順應(yīng)性降低。所以自體細(xì)胞移植也就是種植細(xì)胞技術(shù)很有可能在泌尿系組織的修復(fù)重建方面取得重大突破。我們實(shí)驗(yàn)研究第一部分的目的在于建立用于膀胱組織工程研究的移行上皮細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法。 2.組織工程研究中細(xì)胞支架是另一個(gè)重要因素。理想的

7、細(xì)胞支架應(yīng)該具備良好的細(xì)胞相容性、降解性以及適合組織的結(jié)構(gòu)和功能特性。本實(shí)驗(yàn)所選用的細(xì)胞支架是絲素蛋白膜。絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然纖維蛋白，具有良好的物理化學(xué)性能和生物相容性，因而應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的軟組織相容性材料制作有著廣闊的前景。絲素蛋白已經(jīng)應(yīng)用于手術(shù)縫合線、隱形眼鏡、人工血管、創(chuàng)面覆蓋物、硬腦膜修補(bǔ)材料、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)方面。所以實(shí)驗(yàn)第二部分目的主要是檢測(cè)絲素蛋白膜與膀胱移行上皮細(xì)胞的細(xì)胞相容性，探討構(gòu)建泌尿系腔道組織工程器官

8、的可能性。 研究方法： 1.兔膀胱移行上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法 手術(shù)獲取兔膀胱移行上皮組織，以膠原酶與胰蛋白酶相結(jié)合的方法獲取膀胱移行上皮細(xì)胞，用含有血清，表皮生長(zhǎng)因子的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，接種時(shí)細(xì)胞的密度為2×105/ml，當(dāng)細(xì)胞達(dá)70％～80％融合時(shí)用胰蛋白酶和二胺四乙酸消化細(xì)胞并進(jìn)行傳代。細(xì)胞在37℃、5％CO2孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)、增殖過(guò)程。最后對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免

9、疫熒光檢測(cè)。 2.兔膀胱移行上皮細(xì)胞與絲素蛋白膜相容性的研究 利用MTT比色法檢測(cè)絲素蛋白膜對(duì)兔膀胱移行上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性。分別設(shè)立空白組(無(wú)細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(培養(yǎng)基)和實(shí)驗(yàn)組(絲素蛋白膜浸提液)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱移行上皮細(xì)胞，l×104/ml接種于96孔板中，每組各5孔，于接種后24、72和120小時(shí)，通過(guò)MTT法顯色，并于酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度0D值，計(jì)算相對(duì)增殖率，對(duì)絲素蛋白膜與膀胱移行上皮細(xì)胞的相容

10、性進(jìn)行評(píng)估。 統(tǒng)計(jì)方法：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，第24、72和120小時(shí)三個(gè)時(shí)間分別兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(α=0.05)。 研究結(jié)果： 1.兔膀胱移行上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng) 含10％血清及10μg/L表皮生長(zhǎng)因子DMEM/F12體系適合膀胱移行上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞接種后3天，可見(jiàn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，7～8天可傳代，可傳至7～8代。經(jīng)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)證實(shí)，培養(yǎng)的細(xì)胞為兔膀胱移行上皮細(xì)胞。細(xì)胞凍存后復(fù)蘇，

11、其形態(tài)與生命力維持正常。由以上結(jié)果可見(jiàn)，DMEM/F12體系能很好地對(duì)膀胱移行上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并使其增殖。 2.兔膀胱移行上皮細(xì)胞與絲素蛋白膜相容性 第24、72和120小時(shí)實(shí)驗(yàn)組吸光度值分別為0.424±0.020、0.996±0.118和1.285±0.048，陰性對(duì)照吸光度值分別為0.419±0.030、1.105±0.098和1.228±0.052，與陰性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。膀胱移行上皮細(xì)

12、胞在實(shí)驗(yàn)組第24、72和120小時(shí)平均相對(duì)增殖率(relativegrowthrate，RGR)98.66％，評(píng)分絲素蛋白膜總的細(xì)胞毒性為0級(jí)；根據(jù)該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可看出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩條生長(zhǎng)曲線幾乎平行，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響無(wú)明顯差別。 研究結(jié)論： 1.此培養(yǎng)方法能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量移行上皮細(xì)胞，為進(jìn)一步采用組織工程技術(shù)構(gòu)建尿道提供種子細(xì)胞，為治療重度尿道下裂、神經(jīng)原性膀胱、間質(zhì)性膀胱炎和膀胱癌