兔膀胱移行細(xì)胞原代培養(yǎng)及其與絲素膜相容性的研究.pdf

1、組織工程是一門新興的綜合性學(xué)科，它應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，研究和開發(fā)修復(fù)損傷組織和改善其功能的替代物。通過少量組織細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增達(dá)到一定數(shù)量后，接種到具有一定空間結(jié)構(gòu)的支架上，構(gòu)成有生命活力的細(xì)胞支架復(fù)合物，移植到體內(nèi)以達(dá)到修復(fù)或替代組織損傷的目的。組織工程是人類治療組織、器官功能衰退和缺失的研究方向。近十幾年來，泌尿系統(tǒng)組織工程有了迅速的進(jìn)展。國外學(xué)者已經(jīng)開始研究組織工程化膀胱、輸尿管與尿道，并在實(shí)驗動物體內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)器官的替代

2、。由于正常膀胱上皮細(xì)胞體內(nèi)生長微環(huán)境復(fù)雜、不容易在體外復(fù)制，使得種子細(xì)胞的大量擴(kuò)增成為困擾國內(nèi)眾多研究者的一大難題。 研究背景： 泌尿系統(tǒng)器官由于先天性異?；蚝筇煨該p害導(dǎo)致的畸形或缺損(例如：尿道下裂、泄殖腔外翻、神經(jīng)原性膀胱、間質(zhì)性膀胱炎和膀胱癌等)需要進(jìn)行重建或修復(fù)，盡可能恢復(fù)受損器官的結(jié)構(gòu)和功能。以膀胱為例，過去有很多種方法對容量小和低順應(yīng)性膀胱進(jìn)行修復(fù)，例如應(yīng)用大腸、小腸以及胃對病理性膀胱進(jìn)行修復(fù)，但這些方法存在

3、許多并發(fā)癥，如慢性感染、高氯性代謝性酸中毒、黏液分泌過多、形成結(jié)石、磷酸鈣的代謝異常、胃腸功能的紊亂以及膀胱成型術(shù)后仍然有膀胱穿孔和膀胱癌復(fù)發(fā)的可能。產(chǎn)生這些并發(fā)癥的原因就在于：①膀胱與胃腸道的上皮組織功能的不同；②胃腸道黏膜接觸面發(fā)生了改變。目前有很多種修復(fù)方法都是為克服這些并發(fā)癥的發(fā)生，其中包括帶蒂組織移植物修復(fù)和游離組織移植物修復(fù)，游離組織移植物包括皮膚、筋膜、腹膜、心包膜、小腸黏膜下層和脫細(xì)胞基質(zhì)。利用這些移植物修復(fù)膀胱的原理是

4、認(rèn)為膀胱移行上皮細(xì)胞有再生功能，這些移植物能作為一個三維支架，膀胱移行上皮細(xì)胞在支架上生長，最終形成正常膀胱組織。另外還有很多人工合成可降解生物支架：聚乳酸、聚羥基乙酸和聚乳酸與聚羥基乙酸的共聚物。不幸的是單純用這些移植物修復(fù)膀胱的效果并不好，于是在此基礎(chǔ)上構(gòu)思出一種新的方法修復(fù)缺損膀胱，就是將自體膀胱移行上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在體外擴(kuò)增再種植到支架上形成細(xì)胞支架復(fù)合物，最后將細(xì)胞支架復(fù)合物移植到體內(nèi)完成缺損膀胱的修復(fù)。所以隨著細(xì)胞生物學(xué)

5、、組織材料科學(xué)和工程學(xué)的不斷發(fā)展，在不久的將來泌尿系器官缺損的修復(fù)將會取得關(guān)鍵性的突破。 研究目的： 1.目前組織工程技術(shù)中分種植細(xì)胞技術(shù)和不種植細(xì)胞技術(shù)兩種，其中種植細(xì)胞技術(shù)是指通過活檢取得宿主的原代細(xì)胞，經(jīng)過體外擴(kuò)增，再將其種植到可降解的生物膜上，一段時間體外培養(yǎng)后，移植回宿主體內(nèi)，最終形成有功能的組織；而不種植細(xì)胞技術(shù)是指直接將生物可降解材料植入宿主組織缺損部位，通過宿主自身的再生能力達(dá)到組織再生的目的。但有研究表

6、明不種植細(xì)胞技術(shù)在膀胱修復(fù)重建中只是短期效果好，而長期效果不理想。隨著時間的推移不種植細(xì)胞修復(fù)重建的膀胱表現(xiàn)出的不足有：膀胱逼尿肌的再生非常有限，大量膠原組織沉積導(dǎo)致瘢痕纖維化，最終導(dǎo)致膀胱容量減小以及順應(yīng)性降低。所以自體細(xì)胞移植也就是種植細(xì)胞技術(shù)很有可能在泌尿系組織的修復(fù)重建方面取得重大突破。我們實(shí)驗研究第一部分的目的在于建立用于膀胱組織工程研究的移行上皮細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法。 2.組織工程研究中細(xì)胞支架是另一個重要因素。理想的

7、細(xì)胞支架應(yīng)該具備良好的細(xì)胞相容性、降解性以及適合組織的結(jié)構(gòu)和功能特性。本實(shí)驗所選用的細(xì)胞支架是絲素蛋白膜。絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然纖維蛋白，具有良好的物理化學(xué)性能和生物相容性，因而應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的軟組織相容性材料制作有著廣闊的前景。絲素蛋白已經(jīng)應(yīng)用于手術(shù)縫合線、隱形眼鏡、人工血管、創(chuàng)面覆蓋物、硬腦膜修補(bǔ)材料、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)方面。所以實(shí)驗第二部分目的主要是檢測絲素蛋白膜與膀胱移行上皮細(xì)胞的細(xì)胞相容性，探討構(gòu)建泌尿系腔道組織工程器官

8、的可能性。 研究方法： 1.兔膀胱移行上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法 手術(shù)獲取兔膀胱移行上皮組織，以膠原酶與胰蛋白酶相結(jié)合的方法獲取膀胱移行上皮細(xì)胞，用含有血清，表皮生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，接種時細(xì)胞的密度為2×105/ml，當(dāng)細(xì)胞達(dá)70％～80％融合時用胰蛋白酶和二胺四乙酸消化細(xì)胞并進(jìn)行傳代。細(xì)胞在37℃、5％CO2孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長、增殖過程。最后對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免

9、疫熒光檢測。 2.兔膀胱移行上皮細(xì)胞與絲素蛋白膜相容性的研究 利用MTT比色法檢測絲素蛋白膜對兔膀胱移行上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性。分別設(shè)立空白組(無細(xì)胞)、陰性對照組(培養(yǎng)基)和實(shí)驗組(絲素蛋白膜浸提液)。取對數(shù)生長期的膀胱移行上皮細(xì)胞，l×104/ml接種于96孔板中，每組各5孔，于接種后24、72和120小時，通過MTT法顯色，并于酶標(biāo)儀490nm波長下檢測吸光度0D值，計算相對增殖率，對絲素蛋白膜與膀胱移行上皮細(xì)胞的相容

10、性進(jìn)行評估。 統(tǒng)計方法：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，第24、72和120小時三個時間分別兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(α=0.05)。 研究結(jié)果： 1.兔膀胱移行上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng) 含10％血清及10μg/L表皮生長因子DMEM/F12體系適合膀胱移行上皮細(xì)胞生長。細(xì)胞接種后3天，可見上皮細(xì)胞生長，7～8天可傳代，可傳至7～8代。經(jīng)細(xì)胞免疫熒光檢測證實(shí)，培養(yǎng)的細(xì)胞為兔膀胱移行上皮細(xì)胞。細(xì)胞凍存后復(fù)蘇，

11、其形態(tài)與生命力維持正常。由以上結(jié)果可見，DMEM/F12體系能很好地對膀胱移行上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并使其增殖。 2.兔膀胱移行上皮細(xì)胞與絲素蛋白膜相容性 第24、72和120小時實(shí)驗組吸光度值分別為0.424±0.020、0.996±0.118和1.285±0.048，陰性對照吸光度值分別為0.419±0.030、1.105±0.098和1.228±0.052，與陰性對照組比較無明顯差異(P>0.05)。膀胱移行上皮細(xì)

12、胞在實(shí)驗組第24、72和120小時平均相對增殖率(relativegrowthrate，RGR)98.66％，評分絲素蛋白膜總的細(xì)胞毒性為0級；根據(jù)該實(shí)驗數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長曲線可看出實(shí)驗組和對照組兩條生長曲線幾乎平行，說明實(shí)驗組和對照組對細(xì)胞生長的影響無明顯差別。 研究結(jié)論： 1.此培養(yǎng)方法能在短時間內(nèi)獲得大量移行上皮細(xì)胞，為進(jìn)一步采用組織工程技術(shù)構(gòu)建尿道提供種子細(xì)胞，為治療重度尿道下裂、神經(jīng)原性膀胱、間質(zhì)性膀胱炎和膀胱癌