兔角膜緣干細(xì)胞原代培養(yǎng)優(yōu)化方法的初步探索.pdf

1、目的：
　　取新西蘭大白兔的眼角膜緣組織，用DispaseⅡ與胰酶-EDTA分別在4℃與37℃冷熱交替條件下進(jìn)行消化，進(jìn)而分離獲取兔的角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。與常規(guī)的單獨(dú)使用DispaseⅡ在37℃條件下分離獲取的兔角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的方法進(jìn)行比較。通過(guò)對(duì)兩種不同消化方法分離獲取的兔角膜緣干細(xì)胞的生物學(xué)特性的研究，探索兔角膜緣干細(xì)胞原代培養(yǎng)的優(yōu)化方法，為眼表組織工程學(xué)的臨床研究奠定更好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：

2、　　無(wú)菌操作下剪取兔的角膜緣組織，分為優(yōu)化組和常規(guī)組。優(yōu)化組的角膜緣組織分別在DispaseⅡ中4℃與胰酶-EDTA中37℃冷熱交替條件下進(jìn)行消化，常規(guī)組的角膜緣組織在DispaseⅡ中37℃條件下消化，獲取角膜緣干細(xì)胞，然后制成單細(xì)胞懸液，兩組都用含10％胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)以下3種方法進(jìn)行對(duì)比：1、將單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)特征；2、細(xì)胞傳代后接種于24孔板中，進(jìn)行免疫熒光染色，從

3、而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)鑒定；3、細(xì)胞傳代于6孔板上，進(jìn)行結(jié)晶紫染色檢測(cè)其細(xì)胞增殖能力，判斷其干細(xì)胞增殖的特性。
　　結(jié)果：
　　在倒置顯微鏡下觀察到優(yōu)化組與常規(guī)組培養(yǎng)的兔角膜緣干細(xì)胞表現(xiàn)出相似的一般生長(zhǎng)特性；細(xì)胞免疫熒光染色顯示，優(yōu)化組與常規(guī)組均表現(xiàn)為多量的ΔNp63染色，呈胞核綠染；少量的K3染色，胞質(zhì)呈現(xiàn)的是紅色染色。優(yōu)化組與常規(guī)組相比較，優(yōu)化組的ΔNp63陽(yáng)性細(xì)胞較多（P<0.05），而角蛋白K3陽(yáng)性細(xì)胞則較少（P<0.0