兒童白血病的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、第一部分:158例急性淋巴細(xì)胞白血病ALL-2005方案誘導(dǎo)緩解質(zhì)量、風(fēng)險(xiǎn)及中期隨訪報(bào)告。 目的:在保證有效治療的同時(shí)，降低兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）誘導(dǎo)緩解期治療風(fēng)險(xiǎn)。初步評(píng)價(jià)ALL-2005方案臨床療效。 方法:修改XH-99-ALL治療方案，減低誘導(dǎo)治療強(qiáng)度和修正DNR給藥時(shí)間；減少HDMTX次數(shù)，刪除治療后期的間歇性強(qiáng)化治療及表鬼臼毒素（VP－16）的應(yīng)用。在誘導(dǎo)緩解第35天、55天采用FCM檢測(cè)骨髓MRD

2、，分析誘導(dǎo)治療的有效性并作為調(diào)整臨床組別的依據(jù)。分析2005年5月1日～2007年4月30日我院收住初發(fā)ALL實(shí)際可分析的158例連續(xù)病例。根據(jù)方案分為低危、中危和高危組，結(jié)合動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MRD調(diào)整分組，予以相應(yīng)強(qiáng)度的化療。統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)緩解率，評(píng)估誘導(dǎo)治療相關(guān)并發(fā)癥，誘導(dǎo)緩解第35天、55天MRD水平及隨訪結(jié)果。統(tǒng)計(jì)終點(diǎn)為無病生存、復(fù)發(fā)、死亡。治療中失訪者以失訪時(shí)實(shí)際狀態(tài)和時(shí)間計(jì)算。 結(jié)果:根據(jù)分組標(biāo)準(zhǔn)，158例中低危59例，中危93例

3、（其中14例根據(jù)MRD檢測(cè)水平由低危轉(zhuǎn)為中危組），治療中轉(zhuǎn)為高危6例。35天誘導(dǎo)緩解率為98.11％（155/158），與XH-99方案相比(91.8％）p=0.008。有MRD可檢測(cè)標(biāo)記者139例，覆蓋率為88.0％。94例誘導(dǎo)治療35天時(shí)MRD ≤0.01％，占68.61％（94/137，另2例特殊原因未跟蹤）；其中低危組為73.13％（49/67例）、中危組為63.38％(45/71例)，兩組比較p=0.219。43例患兒誘導(dǎo)期出

4、現(xiàn)發(fā)熱等感染征象，占27.22％（43/158）；與XH-99方案相比(57.4％）p=0.00。合并重癥感染進(jìn)入PICU 2例，占1.27％，與XH-99方案9.1％相比p=0.001。誘導(dǎo)期合并癥死亡1例，占0.63％，與XH-99方案3.7％相比p=0.047。復(fù)發(fā)17例，占10.76％（17/158），復(fù)發(fā)者占誘導(dǎo)緩解35天MRD≤0.01％組4.26％（4/94），占MRD>0.01％組23.26％（10/43）。兩組間p=0

5、.003。至2008年3月31日，中位隨訪時(shí)間為20.0±8.13m（0.26～34m）。估計(jì)30個(gè)月的總體生存率為81.6±4.52％。 結(jié)論:與XH-99方案相比，ALL-2005方案誘導(dǎo)治療期感染率和治療相關(guān)死亡明顯降低。誘導(dǎo)緩解率和緩解質(zhì)量未受影響，對(duì)長(zhǎng)期無病生存率影響有待進(jìn)一步隨訪。 第二部分:WT-1質(zhì)粒的構(gòu)建及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的建立及臨床意義的初步研究。 目的:構(gòu)建WT1質(zhì)粒及建立實(shí)時(shí)定量聚合

6、酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）監(jiān)測(cè)兒童白血病骨髓樣本W(wǎng)T1基因的實(shí)驗(yàn)方法。初步研究WT1基因在兒童白血病中的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義。 方法:參考國外文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)合成WT1基因引物及探針，利用分子克隆的方法構(gòu)建含有目的基因WT1片段的質(zhì)粒，并以此作為陽性對(duì)照檢測(cè)兒童白血病骨髓樣本。通過Taqman熒光探針RQ-PCR方法分別對(duì)WT1目的基因及GAPDH內(nèi)參基因進(jìn)行檢測(cè)，系列稀釋W(xué)T1及GAPDH質(zhì)粒，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對(duì)WT1基

7、因的表達(dá)水平進(jìn)行絕對(duì)定量，檢測(cè)結(jié)果用WT1與GAPDH基因拷貝數(shù)比值表示（WT1/104·GAPDH）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果:經(jīng)酶切電泳和測(cè)序分析證實(shí)構(gòu)建的質(zhì)粒中成功插入了WT1基因片段，可作為RQ-PCR方法中的陽性對(duì)照；成功建立了WT1基因的RQ-PCR檢測(cè)方法，目的基因和內(nèi)參基因的Ct值與起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值呈反向直線相關(guān)（決定系數(shù)R2>0.99）。實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性及敏感性滿意。對(duì)于兒童

8、白血病標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果顯示：新發(fā)AML患兒WT1基因表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（新發(fā)AML組WT1/104·GAPDH 9.2331±37.6228，正常對(duì)照組0.04823±0.034815），其次為BCR-ABL陽性的CML患兒（0.10801±0.061557），新發(fā)ALL患兒WT1基因表達(dá)水平（0.06046±1.612378）與正常組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，緩解中的AML患兒WT1基因表達(dá)水平較新發(fā)時(shí)明顯下降（緩解中AML組