兒童白血病的臨床與基礎研究.pdf

1、第一部分:158例急性淋巴細胞白血病ALL-2005方案誘導緩解質量、風險及中期隨訪報告。 目的:在保證有效治療的同時，降低兒童急性淋巴細胞白血病（ALL）誘導緩解期治療風險。初步評價ALL-2005方案臨床療效。 方法:修改XH-99-ALL治療方案，減低誘導治療強度和修正DNR給藥時間；減少HDMTX次數，刪除治療后期的間歇性強化治療及表鬼臼毒素（VP－16）的應用。在誘導緩解第35天、55天采用FCM檢測骨髓MRD

2、，分析誘導治療的有效性并作為調整臨床組別的依據。分析2005年5月1日～2007年4月30日我院收住初發(fā)ALL實際可分析的158例連續(xù)病例。根據方案分為低危、中危和高危組，結合動態(tài)監(jiān)測MRD調整分組，予以相應強度的化療。統(tǒng)計誘導緩解率，評估誘導治療相關并發(fā)癥，誘導緩解第35天、55天MRD水平及隨訪結果。統(tǒng)計終點為無病生存、復發(fā)、死亡。治療中失訪者以失訪時實際狀態(tài)和時間計算。 結果:根據分組標準，158例中低危59例，中危93例

3、（其中14例根據MRD檢測水平由低危轉為中危組），治療中轉為高危6例。35天誘導緩解率為98.11％（155/158），與XH-99方案相比(91.8％）p=0.008。有MRD可檢測標記者139例，覆蓋率為88.0％。94例誘導治療35天時MRD ≤0.01％，占68.61％（94/137，另2例特殊原因未跟蹤）；其中低危組為73.13％（49/67例）、中危組為63.38％(45/71例)，兩組比較p=0.219。43例患兒誘導期出

4、現(xiàn)發(fā)熱等感染征象，占27.22％（43/158）；與XH-99方案相比(57.4％）p=0.00。合并重癥感染進入PICU 2例，占1.27％，與XH-99方案9.1％相比p=0.001。誘導期合并癥死亡1例，占0.63％，與XH-99方案3.7％相比p=0.047。復發(fā)17例，占10.76％（17/158），復發(fā)者占誘導緩解35天MRD≤0.01％組4.26％（4/94），占MRD>0.01％組23.26％（10/43）。兩組間p=0

5、.003。至2008年3月31日，中位隨訪時間為20.0±8.13m（0.26～34m）。估計30個月的總體生存率為81.6±4.52％。 結論:與XH-99方案相比，ALL-2005方案誘導治療期感染率和治療相關死亡明顯降低。誘導緩解率和緩解質量未受影響，對長期無病生存率影響有待進一步隨訪。 第二部分:WT-1質粒的構建及實時定量PCR檢測方法的建立及臨床意義的初步研究。 目的:構建WT1質粒及建立實時定量聚合

6、酶鏈反應（RQ-PCR）監(jiān)測兒童白血病骨髓樣本WT1基因的實驗方法。初步研究WT1基因在兒童白血病中的表達特點及臨床意義。 方法:參考國外文獻，設計合成WT1基因引物及探針，利用分子克隆的方法構建含有目的基因WT1片段的質粒，并以此作為陽性對照檢測兒童白血病骨髓樣本。通過Taqman熒光探針RQ-PCR方法分別對WT1目的基因及GAPDH內參基因進行檢測，系列稀釋WT1及GAPDH質粒，建立標準曲線，利用雙標準曲線法，對WT1基

7、因的表達水平進行絕對定量，檢測結果用WT1與GAPDH基因拷貝數比值表示（WT1/104·GAPDH）。實驗結果應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。 結果:經酶切電泳和測序分析證實構建的質粒中成功插入了WT1基因片段，可作為RQ-PCR方法中的陽性對照；成功建立了WT1基因的RQ-PCR檢測方法，目的基因和內參基因的Ct值與起始模板拷貝數的對數值呈反向直線相關（決定系數R2>0.99）。實驗的可重復性及敏感性滿意。對于兒童

8、白血病標本的檢測結果顯示：新發(fā)AML患兒WT1基因表達水平明顯高于正常對照組（新發(fā)AML組WT1/104·GAPDH 9.2331±37.6228，正常對照組0.04823±0.034815），其次為BCR-ABL陽性的CML患兒（0.10801±0.061557），新發(fā)ALL患兒WT1基因表達水平（0.06046±1.612378）與正常組的差異無統(tǒng)計學意義。另外，緩解中的AML患兒WT1基因表達水平較新發(fā)時明顯下降（緩解中AML組