HIV-AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、　　目的：本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,以 HIV/AIDS 最常見的中醫(yī)基本證候濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者為研究對(duì)象,與同地區(qū)健康人作對(duì)照。提取受試者全血中的總 RNA,檢測(cè)出HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證差異mRNA和MicroRNA；使用溫病經(jīng)典方三仁湯顆粒劑加減進(jìn)行藥物干預(yù)進(jìn)行反證的方法,運(yùn)用定量 PCR技術(shù)確認(rèn)HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的特異性 mRNA 和 MicroRNA,分析濕熱內(nèi)蘊(yùn)證型相應(yīng)的中藥干預(yù)后使患者的部分異常變化向正常轉(zhuǎn)歸的基因,并

2、對(duì)這些轉(zhuǎn)歸基因和相關(guān)通路進(jìn)行深入分析, 檢驗(yàn)HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的轉(zhuǎn)錄組學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),探索HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證形成的分子機(jī)制,構(gòu)建HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證分子網(wǎng)絡(luò),為HIV/AIDS中醫(yī)證型客觀化研究和療效評(píng)價(jià)提供一定的依據(jù)。建立證候研究的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)平臺(tái),為從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平探討中醫(yī)證本質(zhì)提供思路和方法。
　　方法：實(shí)驗(yàn)標(biāo)本源自河南省某地區(qū)艾滋病濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者和同地區(qū)的健康人對(duì)照,西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)家衛(wèi)生部2011年

3、版《艾滋病診療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)。濕熱內(nèi)蘊(yùn)證中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用本項(xiàng)目組前期國(guó)家級(jí)課題成果“HIV/AIDS 常見證候診斷量表”。使用博奧公司的DNA chips芯片,運(yùn)用BRB-ArrayTools (Version 4.2)軟件對(duì)各種基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,應(yīng)用單變量樣品配對(duì) T檢驗(yàn)進(jìn)行差異基因篩選,通過(guò)上、下調(diào)基因本體功能和信息通路,主要應(yīng)用 DAVID Tools (http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)在線分析,

4、上下調(diào)基因相互作用分析,主要應(yīng)用 STRING(http：//string.embl.de),及 BRB-ArrayTools 4.2 軟件附帶的轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析,聚類分析采用層積聚類,對(duì)每張芯片信號(hào)值 以genes 為中心,metric為centered correlation,linkage為average linkage,對(duì)樣品和差異信號(hào)進(jìn)行雙向?qū)臃e聚類。
　　結(jié)果：運(yùn)用 BRB-ArrayTools (Ver

5、sion 4.2)軟件對(duì) HIV/AIDS 濕熱內(nèi)蘊(yùn)證病人組和健康對(duì)照組的基因進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,數(shù)據(jù)過(guò)濾為Percent of data missing or filtered out exceeds 50 % ,Percent of absent (i.e., Detection Call =A) data exceeds 50 %的標(biāo)準(zhǔn)下過(guò)濾：HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組和健康對(duì)照組相關(guān)分析：發(fā)現(xiàn)mRNA-MicroRNA 105對(duì),

6、73條靶基因,根據(jù)靶基因之間相互作用,組成 105 個(gè)節(jié)點(diǎn),180 個(gè)邊的相互關(guān)系圖,HIV/AIDS 濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組和健康對(duì)照組miRNA 和 mRNA 關(guān)系：此 73 條靶基因主要參與對(duì)組織反應(yīng)、調(diào)節(jié)增殖、凋亡等,有3條基因(FOS, CXCR4, CCL4)主要參與BIOCARTA Pertussis toxin-insensitive CCR5 Signaling in Macrophage信號(hào)通路。HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組病

7、人治療后表 達(dá)轉(zhuǎn)歸基因25個(gè),涉及信號(hào)通路16個(gè)。主要參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、代謝途徑。通過(guò)聚類分析,基因表達(dá)譜可以顯示治療后與治療前比較差異基因顯著減少,具有向正常組轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),更好的顯示出藥物干預(yù)后基因的轉(zhuǎn)歸變化。
　　結(jié)論：
　　1 整合基因mRNA表達(dá)譜芯片和MicroRNA芯片技術(shù)建立了HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證相關(guān)分子相互作用網(wǎng)絡(luò),研究了艾滋病濕熱內(nèi)蘊(yùn)證分子機(jī)制。
　　2.濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患

8、者進(jìn)行三仁湯干預(yù)后,治療前后的差異性基因轉(zhuǎn)歸趨向于正常對(duì)照組,提示三仁湯對(duì)艾滋病濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者有一定的治療作用。
　　3.濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組和健康組差異 MicroRNA與靶基因之間的關(guān)聯(lián)性分析,得出相關(guān)聯(lián)的73條靶基因主要參與對(duì)組織反應(yīng)、調(diào)節(jié)增殖、凋亡等,有 3條基因(FOS, CXCR4, CCL4)主要參與BIOCARTA Pertussis toxin-insensitive CCR5 Signaling in Macrop

9、hage信號(hào)通路。
　　4.濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者進(jìn)行三仁湯干預(yù)后,有25條差異性基因向正常轉(zhuǎn)歸。涉及信號(hào)通路16個(gè)。轉(zhuǎn)歸基因主要具有酶活性、結(jié)合蛋白、加工修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等功能,參與糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝、類固醇代謝、碳水化合物代謝途徑、脂肪酸生物合成途徑,并參與細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程。
　　本研究認(rèn)為有必要以轉(zhuǎn)錄組學(xué)基點(diǎn),在差異基因信息和變化規(guī)律、差異基因的篩選鑒定、表觀遺傳學(xué)及microRNA 調(diào)控的作用機(jī)制

10、、轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的特定基因簇、蛋白質(zhì)群、代謝標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及代謝組的比較和關(guān)聯(lián) 4 個(gè)方面開展深入的交叉研究。這樣不僅可以發(fā)現(xiàn)一些基因在 HIV/AIDS 濕熱內(nèi)蘊(yùn)證中發(fā)揮的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。還可闡明和該證型的相關(guān)基因調(diào)控的 microRNA 及其靶基因群建立的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。以及多個(gè)基因交互調(diào)控通路的相互作用。從而發(fā)現(xiàn)和艾滋病相關(guān)中醫(yī)證型易感性相關(guān)的特異基因,下一步進(jìn)行和蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)相關(guān)聯(lián)的整體組學(xué)研究