組胺酸脫羧酶基因敲除小鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬CA1區(qū)突觸可塑性的改變.pdf

1、組胺是體內(nèi)廣泛存在的自體活性物質(zhì)和炎癥介質(zhì),在20世紀(jì)80年代兩個(gè)研究組同時(shí)用免疫組織化學(xué)的方法證實(shí)了組胺能神經(jīng)元主要分布在下丘腦,組胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用才逐漸為人們所承認(rèn)和重視.目前認(rèn)為腦內(nèi)組胺能神經(jīng)元廣泛分布于下丘腦的結(jié)節(jié)乳頭核(nucleus tuberomammiliaris,TM),而且TM是腦內(nèi)組胺能神經(jīng)元分布的唯一區(qū)域,但其軸突可以投射到腦內(nèi)的絕大部分區(qū)域,包括丘腦、杏仁核、海馬結(jié)構(gòu)、大腦皮層等.組胺在腦內(nèi)由其前體組胺

2、酸(L-histidine)脫羧生成,組胺酸脫羧酶(histidine decarboxylase,HDC)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一組胺合成酶.在中樞神經(jīng)系統(tǒng),組胺有三種受體(H1、H2、H3),均已得到分離鑒定,它們屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族,具有七個(gè)跨膜區(qū)域.H1受體與磷脂酶C(phospholipase C)、蛋白激酶C(protein KinaSe C)藕聯(lián),H2受體與cAMP、蛋白激酶A(protein kinase A)耦聯(lián).H3受體

3、與Gi/Go藕聯(lián),是突觸前自身受體,對(duì)組胺的釋放有抑制作用,也影響組胺的合成.同時(shí),它也是異源性受體,在黑質(zhì)紋狀體、杏仁核、大腦皮層等區(qū)域調(diào)節(jié)其它遞質(zhì)的釋放.總體上,H1和H2受體對(duì)神經(jīng)元起興奮性作用,或增強(qiáng)其興奮性傳入.相反,H3受體激活對(duì)TM神經(jīng)元產(chǎn)生負(fù)反饋抑制,并能抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放. 組胺作為神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)或調(diào)質(zhì),在許多中樞活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用,如神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、飲水?dāng)z食調(diào)節(jié)、體溫調(diào)節(jié)、覺(jué)醒-睡眠、運(yùn)動(dòng)、攻擊行為以及

4、學(xué)習(xí)記憶等.學(xué)習(xí)汜憶是腦的高級(jí)功能,在許多發(fā)病率較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,病人的學(xué)習(xí)記憶功能均受到不同程度的損害.因此,組胺與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系成為越來(lái)越多的研究者致力的熱點(diǎn)問(wèn)題.但隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)組胺系統(tǒng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響十分復(fù)雜,對(duì)組胺以及組胺系統(tǒng)的相關(guān)藥物在行為學(xué)方面的研究均出現(xiàn)不一致的結(jié)果.其中較為重要的原因是,組胺系統(tǒng)的藥理學(xué)工具特異性相對(duì)較低,并沒(méi)有選擇性的、能夠顯著持久的抑制腦內(nèi)組胺合成,及同時(shí)拮抗所有組股受體的工具藥.

5、因此,越來(lái)越多的研究者采用HDC基因敲除(HDC-KO)小鼠來(lái)探討組胺長(zhǎng)期缺乏后對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響.研究表明,HDC-KO小鼠對(duì)物體的辨別記憶能力較其野生型(wild type,WT)小鼠下降,而在水迷宮和被動(dòng)回避反應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng),并認(rèn)為其與多巴胺的負(fù)性增強(qiáng)有關(guān).但是這種假設(shè)需要在其它學(xué)習(xí)汜憶模型中進(jìn)一步證明,同時(shí)這些研究均停留在行為學(xué)水平,沒(méi)有探討其增強(qiáng)效應(yīng)的深入機(jī)制.由于背景和空間學(xué)習(xí)記憶與海馬結(jié)構(gòu)的突觸可塑性密切相關(guān),在組胺的

6、長(zhǎng)期缺乏的情況下是否影響HDC-KO小鼠的海馬的突觸可塑性,而且在學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)任務(wù)中,這種突觸可塑性是否發(fā)生改變,如何改變,至今仍不清楚. 因此為了進(jìn)一步研究組胺長(zhǎng)期缺乏對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響及其深入機(jī)制,本研究采用海馬依賴的背景恐懼記憶模型,觀察HDC-KO小鼠的學(xué)習(xí)記憶改變;同時(shí)用細(xì)胞外電生理記錄HDC-KO小鼠突觸可塑性的改變,探討行為學(xué)改變的生理機(jī)制. 第一部分HDC基因敲除小鼠背景恐懼記憶的改變 近年來(lái),

7、恐懼條件反射模型(Pavlovian fear conditioning)逐漸成為研究學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的主要行為學(xué)模型,分為背景恐懼條件反射(cntextual fearconditioning)和線索恐懼條件反射(cued fear conditioning).在這個(gè)模型中,小鼠需要在訓(xùn)練中將儀器背景刺激及聲音刺激(conditioned stimulus)和足底電刺激(unconditioned stimulus)聯(lián)系起來(lái),產(chǎn)

8、生對(duì)背景或聲音的恐懼記憶,當(dāng)小鼠再次暴露到相同背景或者在不同背景中的聲音刺激時(shí),小鼠會(huì)表現(xiàn)出呆滯反應(yīng)(freezing),其持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短是衡量恐懼記憶能力的標(biāo)志.背景恐懼記憶而不是線索恐懼記憶依賴于海馬.為了進(jìn)一步研究組胺長(zhǎng)期缺乏在海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶的重要作用,我們采用背景恐懼條件反射模型,觀察HDC-KO小鼠的學(xué)習(xí)記憶是否發(fā)生改變.RT-PCR和高效液相結(jié)果顯示HDC-KO小鼠不含有HDC基因,而且體內(nèi)組胺含量極低.免疫印記發(fā)現(xiàn)HD

9、C-KO小鼠海馬細(xì)胞膜H2受體上調(diào).行為學(xué)結(jié)果顯示,給予電刺激后,HDC-KO小鼠的呆滯反應(yīng)時(shí)問(wèn)百分率從2h開(kāi)始較WT小鼠升高,至訓(xùn)練后ld有顯著性升高,并且一直持續(xù)到訓(xùn)練后14d.這些結(jié)果提示HDC-KO小鼠對(duì)背景恐懼記憶較WT小鼠顯著增強(qiáng),其時(shí)程的改變提示組胺長(zhǎng)期缺乏可能參與海馬的獲得和鞏固.我們進(jìn)一步在訓(xùn)練前、訓(xùn)練后以及測(cè)試前腦室內(nèi)注射組胺來(lái)確定背景恐懼記憶的增強(qiáng),同時(shí)探討組胺的缺乏將影響獲得、鞏固和再現(xiàn)中的哪個(gè)過(guò)程.結(jié)果發(fā)現(xiàn),在

10、訓(xùn)練前、訓(xùn)練后注射組胺明顯降低HDC-KO小鼠呆滯反應(yīng)的時(shí)間百分率,在測(cè)試前注射沒(méi)有影響,證明組胺長(zhǎng)期缺乏可能影響了海馬的獲得和鞏固過(guò)程,對(duì)再現(xiàn)過(guò)程沒(méi)有影響.對(duì)線索恐懼記憶的結(jié)果表明,HDC-KO小鼠在未受電擊的環(huán)境中受到聲音刺激時(shí),其呆滯反應(yīng)時(shí)間也延長(zhǎng),提示組胺長(zhǎng)期缺乏導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶增強(qiáng)對(duì)海馬的依賴可能不是特異性的. 第二部分 HDC基因敲除小鼠的突觸可塑性改變 海馬在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中突觸可塑性的形成重要作用,海馬的長(zhǎng)時(shí)

11、程增強(qiáng)(Lorig-term potentiation,LTP) 是研究的最為廣泛的活性依賴的突觸可塑性的模型,被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ).海馬齒狀回、CA3、CA1均有習(xí)得性長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的突觸效應(yīng),其中以Schaffer側(cè)支與CA1形成的通路與空問(wèn)背景學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切.在第一部分中,我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)組胺的長(zhǎng)期缺乏增強(qiáng)HDC-KO小鼠的背景學(xué)習(xí)記憶,并影響獲得和鞏固過(guò)程.在本部分實(shí)驗(yàn)中,主要研究行為學(xué)改變的突觸可塑性機(jī)制.細(xì)胞外電生理結(jié)果

12、顯示,HDC-KO小鼠的基本輸入輸出曲線(input-output CUIve)較WT小鼠沒(méi)有明顯改變,即CA1區(qū)的基本突觸傳遞并沒(méi)有因?yàn)榍贸鼿DC基因而改變;在TBS刺激后HDC-KO小鼠的群峰電位增強(qiáng)的幅度明顯高于WT小鼠,即HDC-KO小鼠的LTP較、WT小鼠顯著增強(qiáng),并可以持續(xù)2h直到記錄結(jié)束;10μM組胺灌流小鼠海馬腦片,給予TBS刺激誘導(dǎo)LTP后,其幅度明顯下降,說(shuō)明HDC-KO小鼠LTP的增強(qiáng)是由組胺的長(zhǎng)期缺乏特異性引起的

13、:HDC-KO小鼠的雙脈沖易化在LTP誘導(dǎo)前后有明顯差異,特別是誘導(dǎo)后較WT小鼠顯著下降,提示在LTP誘導(dǎo)后,HDC-KO小鼠的突觸前谷氨酸釋放增加,參與了LTP的增強(qiáng)效應(yīng);而在訓(xùn)練后1d時(shí),兩種基因型小鼠的LTP較正常時(shí)均明顯下降,但WT小鼠的LTP幅度反而明顯高于HDC-KO小鼠的LTP,提示HDC-KO小鼠的背景恐懼記憶明顯增強(qiáng)時(shí),突觸傳遞已經(jīng)維持在較高的水平,LTP出現(xiàn)飽和現(xiàn)象,進(jìn)一步證明其行為學(xué)的改變,以及LTP與聯(lián)合性學(xué)習(xí)記

14、憶的相關(guān)性. 總結(jié)： 1.內(nèi)源性組胺長(zhǎng)期缺乏導(dǎo)致背景恐懼記憶增強(qiáng),這種增強(qiáng)作用從訓(xùn)練后2h開(kāi)始,一直持續(xù)到14d.組胺腦室內(nèi)注射提示,組胺長(zhǎng)期缺乏對(duì)海馬的獲得和鞏固過(guò)程有明顯影響.HDC-KO小鼠對(duì)聲音的恐懼記憶亦增強(qiáng),提示組胺長(zhǎng)期缺乏對(duì)背景恐懼記憶的影響并不是特異性的,其不僅對(duì)海馬的功能有影響,也可能影響杏仁核的功能. 2.兩種基因型小鼠海馬腦片的電生理記錄顯示,雖然HDC-KO小鼠的輸入輸出曲線左移,但與WT

15、對(duì)照小鼠比較沒(méi)有顯著性差異,提示HDC-KO小鼠的基本電生理特性沒(méi)有發(fā)生明顯改變;內(nèi)源性組胺長(zhǎng)期缺乏導(dǎo)致HDC-KO小鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP增強(qiáng),而LTD沒(méi)有發(fā)生明顯變化;LTP誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的PPF下降,以及生化結(jié)果發(fā)現(xiàn)行為學(xué)訓(xùn)練后1d和4d海馬內(nèi)谷氨酸含量增加,提示突觸前谷氨酸釋放增加可能參與背景恐懼記憶和LTP的增強(qiáng)效應(yīng); 3.HDC-KO小鼠訓(xùn)練后ld海馬腦片電生理記錄顯示,LTP幅度較WT小鼠明顯降低,提示訓(xùn)練后1d