RyRs在鉛致大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　　環(huán)境鉛（Lead，Pb）所致的健康損害，尤其是對(duì)兒童學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的損害越來越受到人們的關(guān)注。大腦突觸可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）是研究突觸可塑性的理想模型。鈣在LTP的形成中發(fā)揮著重要作用，鉛和鈣同為二價(jià)離子，鉛可以阻斷和模擬鈣離子的作用干擾鈣介導(dǎo)的細(xì)胞生化過程。研究表明，鉛暴露能夠影響海馬 RyR2和（或）RyR3蛋白來調(diào)控海馬神經(jīng)元內(nèi)靜

2、息鈣離子濃度，提示RyRs可能作為鉛的作用靶點(diǎn)介導(dǎo)鉛的學(xué)習(xí)記憶損害。本研究通過電生理膜片鉗相關(guān)技術(shù)，在整體突觸功能以及細(xì)胞生理水平上，進(jìn)一步探討RyRs在鉛暴露所致學(xué)習(xí)記憶損害中的作用及機(jī)制，為最終闡明鉛暴露的神經(jīng)毒理學(xué)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　方法：
　　1、SD大鼠腦片制備：
　　取自動(dòng)物房的SD大鼠待其情緒安靜后，用適量麻醉劑行腹腔注射。而后立即斷頭，再用剪刀沿大腦矢狀線方向剪開，取出全腦并快速置于通有飽和9

3、5％O2＋5%CO2混合氣的冰水混合的切片液中。冷卻后，取出全腦，修片后用濾紙輕輕吸干腦組織上的液體，用502膠水粘置于振動(dòng)切片機(jī)的標(biāo)本托臺(tái)上，在通氧的切片液冰水混合物中切成待用腦片若干，將切好的腦片輕柔的轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的孵育槽中，孵育槽盛有飽和95%O2＋5%CO2混合氣的人工腦脊液。
　　2、大鼠海馬CA1區(qū)整體突觸場(chǎng)興奮性突觸后電位（fEPSP）和LTP的記錄：
　?。?）、場(chǎng)興奮性突觸后電位的記錄：
　　取3

4、5~42天的大鼠制成400μm厚度的離體腦片，孵育后，用含有不同濃度鉛和（或）其他藥物的人工腦脊液進(jìn)行灌流。在低倍鏡目鏡下觀察腦片，分別用刺激電極放置于CA2-CA1交界的放射層（Schaefer側(cè)枝）并壓在腦片表面，記錄電極扎入CA1區(qū)樹突棘，記錄場(chǎng)興奮性突觸后電位。
　?。?）、LTP記錄：
　　移動(dòng)兩根電極的相對(duì)位置以獲得最佳的波形。玻璃記錄電極充灌ACSF溶液，阻抗為3~6 MΩ。選擇最大刺激強(qiáng)度的30%~40%作為

5、刺激強(qiáng)度，記錄fEPSP穩(wěn)定后10 min作為基線，給予高頻刺激或藥物誘導(dǎo)LTP。以上電流信號(hào)均由片鉗系統(tǒng)電流鉗（I=0）模式下記錄采集。
　　3、大鼠海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元全細(xì)胞模式胞內(nèi)鈣信號(hào)記錄：
　　取14~18天的大鼠制成350μm厚度的離體腦片，將CA1區(qū)椎體神經(jīng)元細(xì)胞封接破膜后形成全細(xì)胞模式，電流信號(hào)由膜片鉗系統(tǒng)電壓鉗模式下記錄采集，將電壓鉗制在-30mV。記錄鉛染毒前后ACh和cADPR誘發(fā)鈣激活性氯通道電流來

6、反映胞內(nèi)鈣信號(hào)的改變。
　　研究結(jié)果：
　　1、鉛暴露對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)LTP的影響：
　　結(jié)果顯示，待fEPSP基線穩(wěn)定后，給予高頻刺激，可以誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū) LTP；不同濃度（5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）鉛預(yù)灌流染毒，可以顯著降低大鼠海馬CA1區(qū)LTP，且具有一定的濃度依賴性；10μmol/L鉛全程灌流染毒可以完全抑制海馬CA1區(qū)LTP（P＜0.01）。
　　2、RyRs在大鼠海馬

7、CA1區(qū)LTP中的作用：
　　RyRs抑制劑ryanodine可以顯著抑制大鼠海馬CA1區(qū)LTP（P＜0.01）；單獨(dú)RyRs激動(dòng)劑caffeine能夠誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)LTP；RyRs抑制劑ryanodine可以顯著的抑制caffeine誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)LTP（P＜0.05）。
　　3、RyRs在鉛致的海馬CA1區(qū)LTP損傷中的作用：
　　Caffeine誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)LTP可以被鉛抑制（P＜0.05

8、）；內(nèi)源性RyRs激動(dòng)劑cADPR可以部分逆轉(zhuǎn)鉛對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)LTP的損傷（P＜0.05）。
　　4、RyRs介導(dǎo)鈣信號(hào)在鉛致大鼠海馬CA1區(qū)LTP損傷中作用：
　　鉛可抑制ACh誘導(dǎo)的鈣信號(hào)振蕩（P＜0.05）；鉛可以抑制胞內(nèi)cADPR激活的鈣信號(hào)振蕩（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、鉛暴露可損害大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性。
　　2、RyRs參與大鼠海馬CA1區(qū)LTP的形成。
　　3、鉛可